细胞凋亡的检测方法

细胞凋亡：细胞最好的消失方式，没有之一细胞凋亡（Apoptosis）,又称程序性细胞死亡（ProgrammedCellDeath，PCD），是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命，有一系列酶参与、由基因控制的一个主动的、高度有序的、非炎症性细胞死亡的过程。近年来已在很多领域如胚胎学、内分泌学、免疫学，尤其是肿瘤学方面引起广泛的兴趣和关注，其研究可能有助于阐明肿瘤发病机理并为其治疗提供崭新的途径。细胞凋亡不同于细胞坏死：细胞凋亡与细胞坏死的区别坏死（necrosis）是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程，表现为细胞胀大、胞膜破裂、细胞内容物外溢、核变化较慢、DNA降解不充分和引起严重的局部炎症反应等。凋亡是细胞对环境的生理性或病理性刺激信号、环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程，是一种基本的细胞生物学现象，在多细胞生物中起着去除不需要细胞或异常细胞的作用。表现为细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落等现象。细胞凋亡的检测方法1，形态学观察光镜下细胞凋亡最早变化有细胞体积缩小、细胞核固缩、染色体边集在核膜内侧、核碎裂、细胞浆和细胞器密度增高，细胞膜皱折、卷曲、出泡、胞浆膜包裹细胞碎片“凋亡小体”，凋亡小体是细胞凋亡的特征性改变。电镜下可见在细胞凋亡的早期细胞核染色体发生边集，在细胞核膜周边聚集成新月体形，随之染色体发生固缩、电子密度增强、核形不规整，核碎裂成碎片、细胞体积变小、胞浆浓缩、空泡增多，可见细胞膜丫生出泡现象；在凋亡晚期可见膜泡内有较完整的细胞器和细胞核碎片的凋亡小体。2，生化特征检测细胞凋亡最明显的生化特征是Ca2+、Mg2+依赖性内源性核酸酶的激活将细胞核染色体从核小体间断裂，形成由大约为180-200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段。DNA凝胶电泳法，DNA凝胶电泳表现在：正常活细胞DNA电泳为一条区带,细胞凋亡时核酸内切酶将DNA分解成规则的180-200bp的DNA片段。琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱。DNA电泳法的缺点是不能进行准确定量，只能进行半定量。其灵敏性较差，要求所测标本细胞数在106以上才能使电泳清晰。实验流程如下：收集细胞（5×106-107个cell）→DNA提取（酚氯仿、氯仿抽提）→琼脂糖凝胶电泳→结果分析。TUNEL法，TUNEL法（terminaldexynucleotidyltransferase(TdT)-mediateddUTPnickendlabeling,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法)也称DNA断裂的原位末端标记法，这一方法能对DNA分子断裂缺口中的3'-OH进行原位标记，借助一种可观测的标记物(如荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物)，能对凋亡细胞的核DNA中产生的3'-OH末端进行原位标记，用荧光显微镜即可进行观察。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定。磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，AnnexinV法，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidineiodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。实验流程如下：收集细胞（5×105~106）→细胞染色（AnnexinV，FITC凋亡检测试剂盒）→流式细胞仪上机检测→专业流式软件结果分析（如flowjo）。Caspase-3活性检测法，Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32kD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17kD）和两个小亚基（12kD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞中，caspase-3的活性明显下降。实验流程：（以Westernblot分析为例）收集细胞→PBS洗涤→蛋白提取→蛋白定量→SDS-PAG电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭→一抗孵育（Caspase-3多抗或单抗）→TBS-T（含0.05%Tween20的TBS）洗涤→二抗孵育→TBS-T（含0.05%Tween20的TBS）洗涤→ECL显影或NBT/BCIP显色→结果分析及判定。常见问题解决方案①如何选择合适的凋亡检测方法?定性的研究方法可选DNA电泳法、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）；定量或半定量的研究方法可选各种流式细胞仪方法、原位末端标记法等。DNA琼脂糖凝胶电泳法敏感性不高，大量凋亡细胞同时存在时才出现典型的结果，且只能用于细胞群体，不能用于组织的原位检测；TUNEL法可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用；细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。并且AnnexinV联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，AnnexinV联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。②AnnexinV法通过流式细胞仪检测细胞凋亡时，没有凋亡信号/没有早期凋亡信号？没有检测到凋亡信号说明细胞未被染料标记上。不同公司生产的AnnexinV、FITC细胞凋亡检测试剂盒的生产工艺流程都不一样。首先检查试剂盒储存是否正确（4度还是-20度）以及保质期；其次检查是否严格按照试剂盒所提供的实验说明进行操作。③AnnexinV法通过流式细胞仪检测细胞凋亡时，凋亡信号值过高？在实验操作过程中应动作轻柔、迅速，避免影响细胞的活力及形态。在处理贴壁细胞时应使用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，消化时间不宜太长，染色操作完成时应尽快上机检测。