K-B纸片法

K-B纸片扩散法抗生素敏感性实验PPT制作：光光钰儿现场演讲：子翔小组成员查阅资料：阿妹实验原理实验方法及结果实验优缺点目录实验原理第一部分实验原理纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小实验方法第二部分药敏纸片制备细菌制备实验方法培养基制备接种培养基制备培养基的种类：进行细菌药敏试验所用的培养基种类较多。M—H培养基琼脂浓度越大、抑菌圈直径越小。有研究证明3种不同M—H培养基进行纸片扩散法，实验结果相同。浓度1．0～2．0、pH7．4左右培养基的质量：4mm厚平板，允许±1mm误差，如此控制平板厚度即可满足试验要求。有研究证明，平板每增厚或减薄1mm，抑菌圈相应减小或增大0．7mm。药敏纸片制备实验常规抗菌药物选择：在标准中分成A、B、C、U四组,A组所列的抗生素为常规首选药敏试验药物,B组为临床使用主要抗生素,尤其在医院感染时使用的抗生素，可在下列情况下使用：①对A组同类抗生素耐药；②标本来源不同时，如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶唑使用于尿道分离的细菌；③多种微生物感染；④多部位感染；⑤感染流行的控制；⑤对A组抗生素过敏、耐受或无反应。药敏纸片制备C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或对A组药物过敏的病人和某些不常见的细菌（如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠球菌）。U组仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿道外分离菌的常规药敏试验。药敏纸片制备以大肠杆菌为例①纸片制备：选择优质滤纸，用打孔器制成直径6mm圆形滤纸片。经120℃2h灭菌后备用②药物稀释每张以吸入20μL药液为标准，如纸片薄，药物原液需作调整。根据纸片内各种抗菌药物的不同浓度配制药物原液。药液浓度见下表。③课堂的实验中仅使用了青霉素链霉素氯霉素药敏纸片制备药敏纸片制备④纸片浸润、干燥、保存用无菌操作法将待测的抗菌药物溶液1ml（含药量按表所列计算，例如，庆大霉素10μg/片×100片=1000μg/ml），加入摊布于灭菌平皿中的100片纸片中，置冰箱内浸泡1~2小时，必要时可不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，如立即实验可不烘干，若保存备用可用下列一种方法烘干（干燥的抗菌素纸片可保存6个月）。药敏纸片制备A．培养皿烘干法将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于37℃温箱内保持2~3h即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。B．真空抽干法将放有抗菌药物纸片的试管置于干燥器了，用真空抽气机抽干。药敏纸片制备纸片的保存将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中置冰箱内保存备用。（纸片不应长期保存于常开的普通冰箱中，也不要放在其他不能维持适宜温度的容器中。）收到纸片后应立即保存在-20~4℃中，由于实验室冰箱频繁地开关而不能维持适宜的温度，故常开的冰箱中只能放置1周使用的纸片；纸片容器打开前先置室温平衡（装纸片的容器自冰箱取出后，必须在室温10min以上才能打开，如立即打开，空气中的水分会冷凝在纸片上，易潮解），纸片贴毕应把未用完的放回冰箱中。药敏纸片制备触酶阳性的G＋球菌：青、苯唑、克林、庆大、环丙沙星、万古、红霉素、头孢唑林触酶阴性的G+球菌：青、氨苄、氯、红、利福平、庆大、环丙沙星、万古氧化酶阴性的杆菌：氨苄、丁卡、环丙沙星、庆大、头孢噻肟、复达欣、泰能、哌拉西林氧化酶阳性的杆菌：头他、庆大、哌拉、丁卡、氨曲南、环丙、头孢噻肟、泰能细菌制备从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mLMH肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108个/L。细菌制备下表为麦氏比浊管制法：接种平板①制备好的接种菌液必须在15min内使用。用灭菌好的棉试子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液。然后用试子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60°，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。②粘贴药敏试纸待平板上的水分被琼脂完全吸收后开始贴纸片。用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，用镊子尖轻压，使其贴平。接种平板③15min内置35℃培养箱内培养。培养时，平板需在培养箱内单独摆放，否则中间的平板达不到培养箱内的温度而产生预扩散作用，平板培养18～24h后，读取结果。应注意：纸片一旦贴上就不能再拿起，因为纸片中的药物已经扩散到琼脂中。纸片间距离不小于24mm，纸片中心距平皿边缘不小于15mm。直径为90mm的平板最好贴6张。实验结果第三部分班内实验结果结果判读用尺子准确测量抑菌环的直径(mm)，抑菌圈的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。结果报告应以最小抑菌圈的的直径为准。结果判读结果判定有的菌株可出现蔓延生长进入抑菌圈，磺胺类药的抑菌圈内会出现轻微生长，这些均不作为抑菌圈边缘。按抑菌圈直径判断细菌的敏感性。结果判定实验优缺点第四部分K—B纸片法优点药敏试验具有重复性较好、操作简便、试验成本相对较低、结果直观、容易判读、便于基层开展的优点。K—B纸片法缺点K—B纸片扩散法虽然是一种传统、经典的药敏试验方法，但随着计算机的发展为细菌检验自动化奠定了良好基础，全自动微生物分析仪的推广和应用K—B纸片扩散法出现药敏试验假耐药、受人为因素影响较大、试验耗时长的缺点也渐渐体现出来，同时快速性、准确性方面存在不足。K—B纸片法缺点试验过程受培养基的质量、细菌接种量、培养基、药敏纸片的质量、纸片含药的准确性和均匀性等诸多因素的影响较大，目前尚未规范其影响因素，为了减少各种因素的影响，在实行方法的标准化方面有很多问题有待解决。建议制定统一标准，采取必要的控制措施，以统一试验材料，固定试验条件，减少试验误差，提高K—B纸片扩散法结果的准确率。谢谢聆听！