实验1 大肠杆菌的培养和分离(2018)

实验1：大肠杆菌的培养和分离1、微生物病毒细菌、蓝藻、放线菌酵母菌、霉菌原生动物一、微生物的基础知识(1)定义(2)种类(3)用途•单细胞原核，分支状的菌丝（基内~、气生~）2、细菌——单细胞的原核生物细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察球菌杆菌弧菌•结构•异养型，兼性厌氧型，革兰氏阴性(红色)菌落：•单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。酵母菌放线菌霉菌•菌落是鉴定菌种的重要依据。成分作用主要来源碳源主要作能源物质无机碳(CO2)或有机碳(糖类)氮源合成含N类化合物N2，NH3，铵，硝酸盐尿素，牛肉膏，蛋白胨无机盐调节渗透压等水生长因子调节促生长维生素，AA，碱基等培养基的成分液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长培养基的类型细菌扩大培养固体培养基：细菌的鉴定、分离纯化、计数等培养基的类型半固体培养基：无动力有动力(弥散)(是否运动)动力检测，保种培养基的类型二、无菌技术1.无菌操作的目的防止培养基被其他微生物污染(及避免操作者被微生物感染)无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。2.无菌操作的方法消毒：利用化学或物理方法，杀死大部分微生物的过程。方法较为温和，如酒精（注：消毒不能杀死芽孢）灭菌：以化学或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。方法强烈灭菌消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。1、煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min（牛奶）3、化学药剂消毒法：用70%酒精进行皮肤消毒；氯气消毒水源4、紫外线消毒（空气）(1)常用消毒的方法：(2)常用灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌：100kPa（1kg/cm2）、121℃下维持15-30min.3、无菌技术包括(1)将实验器具和培养基：高压蒸汽灭菌(2)接种环(针)、试管口:灼烧灭菌(3)实验操作空间：酒精+紫外线消毒（接种室(箱)、超净台）(4)双手:酒精消毒(5)实验操作应在酒精灯火焰旁进行(6)棉塞(封口膜):只让空气通过，而空气中的微生物不能通过。紫外灯过滤风超净工作台配制LB培养基并灭菌•从大肠杆菌斜面→锥形瓶中的液体培养基•接种后在37度摇床振荡培养12h•工具：接种环在接种前要灭菌大肠杆菌扩大培养摇床•倒平板倒平板第一区域第二区域第三区域第四区域第五区域恒温培养箱单菌落•将单菌落用划线法接种到斜面，37℃培养124h后放入4度冰箱保藏试管斜面培养可以扩大培养面积,增加了在一个试管内培养的微生物数目，用来做纯细胞的保存。1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。•分离方法：平板划线分离法•原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。•只能蘸一次、再次划线从上次末端开始、划好倒置培养1-2天、划线末端出现不连续的单个菌落1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？•操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物•每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落•划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？•以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？•划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。3、分离培养基灭菌制作平板扩大培养划线分离菌种保存将LB液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌将灭菌后冷却到60℃的LB固体培养基倒入灭菌过的培养皿中，制作平面培养基.将大肠杆菌从斜面接种到LB液体培养基中，然后在37℃摇床中震荡培养12h。用接种环取震荡培养后的菌液，并在固体培养基上划线，然后将划线后的培养皿倒置与37℃的恒温培养箱中培养12~24h，观察划线末端的菌落生长情况.用接种环取单菌落，用划线法接种于斜面上，在37℃的恒温培养箱中培养24h，再放入4℃的冰箱中保存。2、涂布分离法1)稀释菌液（10-5~10-7倍）用无菌吸管吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液。2)涂布用无菌吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。3)培养：将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48h。划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。涂布器