5第六章转录、转录后加工及逆转录

第六章转录、转录后加工及逆转录转录(transcription)：以DNA单链为模板，核苷三磷酸NTP（ATP,GTP,CTP,UTP四种核糖核苷三磷酸）为原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。转录的条件：模板DNA(不对称转录）原料NTP酶RNA聚合酶产物mRNA,tRNA,rRNA配对A--U,T--A,G--C方向5’→3’引物不需要第一节转录的基本特征转录、复制的异同点转录通用公式：模板Nn+NTP模板Nn+1+PPiMg2+RNA聚合酶1.原料是NTP（ATP,GTP,CTP,UTP四种核糖核苷三磷酸）。2.RNA聚合酶+镁。3.起始链核苷酸为嘌呤核苷三磷酸，5‘端保持三磷酸集团。4.DNA双链上，一股链可转录，另一股不转录。5.有意义链与反意义链并非固定不变。6.转录方向都是5’→3’模板链：•反意义链antisensestrand：以该链中的DNA碱基顺序指导RNA的合成-被转录的那条DNA链。编码链：•有意义链sensestrand/templatestrand：不被转录的那条DNA链，但其碱基顺序除T用U代替外，其余与mRNA相同。几个基本概念•5’---GCAGTACATGTC---3’编码链DNA•3’---CGTCATGTACAG----5’模板链•5’--------GCAGUACAUGUC---------3’mRNA•N------Ala----Val----His----Val---C蛋白质有两方面含义：1）DNA分子双链上的某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；2）模版链并非永远在同一单链上。双链DNA分子上分布着很多基因，并不是所有基因的转录均在同一条DNA单链上，而是一些基因在这条单链转录，另一些基因的转录在另一条单链上，DNA双链一次只有一条链可作为模板转录，称之为不对称转录。第二节ＤＮＡ指导下的ＲＮＡ聚合酶•RNA聚合酶——依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolymerase,DDRP）•以DNA为模板，催化2个游离的NTP形成3’，5’--磷酸二酯键。一、原核生物RNA聚合酶1、大肠杆菌RNA聚合酶的组成西格玛全酶(HoloEnzyme)和核心酶(CoreEnzyme)＋σββ’ααCoreEnzymeβααβ’σHoloEnzyme(1)全酶（HoloEnzyme）•用于转录的起始•依靠空间结构与DNA模板结合•专一性地与DNA序列(启动子)结合•转录效率低，速度缓慢（σ的结合）（2）核心酶（CoreEnzyme）•作用于转录的延伸过程•依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间）•非专一性的结合（与DNA的序列无关）2、各亚基的特点和功能（1）σ因子•σ因子可重复使用•修饰RNApol构型•使HoloEnzyme识别启动子的特定区域2α＋βα2ββ’＋σα2β＋β’α2ββ’σ（3）全酶的组装过程•不同的σ因子识别不同的启动子E.coli中有五种σ因子（σ70、σ32、σ54、σ28、σ24）枯草杆菌中有11种σ因子（σ因子的更替对转录起始的调控）（2）α因子核心酶的组建因子•促使RNApol与DNA模板链结合α＋α2α＋βα2β＋β’•前端α因子－－使模板DNA双链变单链•尾端α因子－－使单链DNA重新聚合为双链（3）β因子•促进RNApol＋NTPRNAelongation•完成磷酸酯键的连接•Editing功能（排斥与模板链不互补的碱基）Esite（RifR）:对NTP非专一性地结合（4）β’因子•参与RNA非模板链的结合（充当SSB）•构成Holoenzyme后，β因子含有两个位点Isite（Rifs）:该位点专一性地结合ATP或者GTP（利福霉素rifamycin、利福平rifampin）－－抑制I位点（利迪链菌素（streptollydigin）－－抑制E位点由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点有义DNA链结合位点（β’亚基提供）DNA/RNA杂交链结合位点（β亚基提供）双链DNA解链位点（前端α亚基提供）单链DNA重旋位点（后端α亚基提供）σ因子作用位点1.请叙述端粒酶。79-812.真核生物与原核生物的DNA复制异同点。82-833.突变类型854.简述holliday模型步骤102-1065.简述原核生物RNA聚合酶119-1206.利福霉素和利福平/利迪链霉素作用于哪些因子，哪些位点。126二、真核生物RNA聚合酶（三种）敏感度是指浓度抑制力：高（10-9—10-8mol/L），中（10-5—10-4mol/L），低（大于10-3mol/L）。一、真核生物的RNApol1、三种RNApol：根据对α-鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类RNApolⅠ最不敏感（动、植、昆）RNApolⅡ最敏感RNApolⅢ不同种类（物种）的敏感性不同2、位置和转录产物RNApolⅠ核仁活性所占比例最大转录rRNA（5.8S、18S、28S）RNApolⅡ核质主要负责hnRNA、snRNA的转录hnRNA（mRNA前体，核不均一RNAheterogeneousnuclearRNA）snRNA（核内小分子RNAsmallnulearRNA)RNApolⅢ核质负责tRNA3、亚基组成：分子量500KDa,含两个大亚基和7~12个(4-8)小亚基RNApolⅡ：•大亚基中有C末端结构域(carboxyterminaldomainCTD)•CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复Tyr－Ser－Pro－Thr－Ser－Pro－Ser酪氨酸-丝氨酸-脯氨酸-苏氨酸-丝氨酸-脯氨酸-丝氨酸C端重复七肽•不同生物中重复数目不一样（酶活性）•CTD中的丝氨酸和苏氨酸可被高度磷酸化磷酸化的RNApolⅡ被称为ⅡA非磷酸化的RNApolⅡ称为ⅡB•CTD参与转录→ⅡB→ⅡA→使RNApol易于离开启动子进入延伸过程（10倍）二、真核生物的启动子三种RNApol识别三种启动子三种聚合酶需要不同的转录因子-TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ等注：每种转录因子根据发现的先后再分为A\B\C(TFⅢA\TFⅢB)三种转录方式三种产物：RNA聚合酶Ⅱ——mRNA前体；RNA聚合酶Ⅰ——rRNA；RNA聚合酶Ⅲ——tRNA和5SRNARNA的转录包括promotion.elongation.termination三过程从启动子(promoter)到终止子(terminator)称为转录单位(transcriptionunit)原核生物的转录单位多为操纵子operon真核生物中的转录单位多无operon转录起点即转录原点记为＋1，其上游记为负值，下游记为正值upstreamstartpointdownstream－10＋1＋10一、原核生物启动子和终止子启动子（promoter）:RNA聚合酶的结合区域。启动子的特点:(1)在转录起始点的5’端(2)TTGACA:Sextama框，RNA聚合的识别部位（酶靠σ亚基与之结合），在-35区。(3)TATAAT:Pribnow框，RNA聚合酶的结合区，在-10区。Pribnow框结合位点Sextama框识别位点（1）Sextama框（SextamaBox）§RNA聚合酶的松弛结合（只为识别），§RNA聚合酶依靠其σ亚基识别该位点§决定了启动子的强度§不同启动子中位置略有变动（2）Pribonow框（PribonowBox）§RNA聚合酶的牢固结合位点§一致序列：TATAAT4、RNApol在DNA上结合位点的鉴定足迹法（footprinting）足迹法原理：•限制酶切割结合有RNApol的DNA•末端标记该DNA•用内切酶降解DNA•凝胶电泳分离，放射自显影观察限制酶切分离大片段DNA末端标记大分子DNA重新结合RNApol作对照直接用DNase进行降解电泳用微量DNase降解电泳原核生物的终止子终止子：提供转录终止信号的一段DNA序列。两个主要结构特征：1.反向核苷酸重复序列：5´-CGGATG|CATCCG-3‘反向序列的长度和GC含量直接影响RNA二级结构的稳定性（分子内碱基配对促成了RNA二级结构）2.紧接反向重复序列的连续寡聚U2.原核生物的终止子——一个回文结构（颈环式的发荚结构）。可分为两种：①不依赖于ρ的终止子：有寡聚U序列，回文对称区富含GC序列。②依赖ρ的终止子：无寡聚U序列，回文对称区不含GC。ρ因子-终止因子:是55KD的蛋白质，可水解三磷酸核苷，协助RNA聚合酶识别终止子的辅助因子。例:大肠杆菌色氨酸操纵子-尾-40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区-转录终止子的结构。二、真核生物启动子真核生物中有三种不同的RNA聚合酶，因此也有三种不同的启动子，其中以启动子Ⅱ最为复杂。（1）有多种元件：TATA框/盒，GC框，CAAT框，OCT等；（2）结构不恒定；（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同；（4）有的有远距离的调控元件；（5）元件起到控制转录效率和选择起始位点的作用；（6）转录时先和其它转录激活因子结合，再和聚合酶结合。增强子-200•核心启动子元件：单独发挥作用可确定转录起始点+产生基本水平转录•（1）TATA框：顺序TATAATAAT。在转录起始点上游约-25——-30bp处，基本上由A-T碱基对组成，为RNA聚合酶的结合处之一，RNA聚合酶与TATA框牢固结合之后才能开始转录，RNA聚合酶转录所需最小的DNA序列。•上游启动子元件：控制转录频率，不参与起始位点的确定。•（2）CAAT框：顺序GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的调节区，位于转录起始点上游约-80-100bp处，也是RNA聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。•（3）GC框：有两个拷贝，位于CAAT框的两侧，由GGCGGG组成，是一个转录调节区，有激活转录的功能。真核生物的RNApol1、三种RNApol：根据对α-鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类RNApolⅠ最不敏感（动、植、昆）RNApolⅡ最敏感RNApolⅢ不同种类（物种）的敏感性不同2、位置和转录产物RNApolⅠ核仁活性所占比例最大转录rRNA（5.8S、18S、28S）RNApolⅡ核质主要负责hnRNA、snRNA的转录hnRNA（mRNA前体，核不均一RNA）snRNA（核内小分子RNA)RNApolⅢ核质负责tRNA、5SrRNA和部分snRNA1、RNApolⅡ的启动子•结构最复杂•位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成•通用型启动子（无组织特异性）（1）帽子位点（2）TATA框定位转录起始点的功能（类似原核的Pribnow框）TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的（3）CAAT框（CAATbox）•位于－75bp处•一致序列为GGC/TCAATCT•前两个G的作用十分重要(转录效率)•增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性☻以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在（4）增强子（enhancer）：研究SV40病毒时发现，启动子上游的某些序列若发生变化，则大大降低转录活性，这些序列对转录起增强作用，故称增强子。一段能够加速基因转录的调节性序列，通过改变DNA模板的螺旋结构和顺势调控RNA聚合酶及特异性蛋白。效率高：是转录频率增加10-200倍。特点：1.位置不定（5‘端上游，3端下游，甚至于内含子中）2.序列长，有芯(TGGA/TA/TA/T)3.作用距离远。（延至数千碱基）4.作用无论正反（倒置依然起作用）5.发挥作用需要叠加（启动子+增强子）6.需要特定因子才能发挥作用。（5）GC框（GCbox）•位于－90附近，较常见的成分•核心序列为GGGCGG•可有多个拷贝，也可以正反两方向排列小结：★不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同★不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交启动子功能没有变化★各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，组成起始复合物，蛋白因子间的相互作用决定了转录的起始3、RNApolI启动子结构主要由两部分组成目前了解较清楚的是人的RNA聚合酶I的启