现代分子生物学技术基础第五章

第五章现代分子生物学技术基础中国医科大学医学遗传学教研室孙秀菊二十一世纪医学发展的主要特点之一是对生命现象和疾病本质的认识深入到分子水平。健康的保持或疾病的发生都与生物分子相互作用密不可分，这一理念已成为共识。分子生物学已成为当今生命科学研究的主流,分子生物学技术是相关研究必不可少的工具。多年来,已建立了许多分子生物学技术，新的技术还在不断出现,从不同水平探索生命的奥秘。核酸分析相关技术是其重要基础。本章将以此为起点与核心，介绍分子生物学的常用技术及新进展。研究复杂DNA中特异DNA序列的基本方法本章介绍的相关分子生物学技术一、DNA克隆二、DNA及RNA的分析技术三、蛋白质的表达及蛋白质组学分析的主要技术四、表观遗传学分析技术简介五、转基因动物和基因打靶技术的分子生物学基础一、DNA克隆一.DNA克隆克隆的概念克隆(clone)：是指用无性繁殖的方法产生与亲代完全相同的子代个体或群体。分子克隆（DNA克隆）细胞克隆个体克隆（动物或植物）精细胞卵细胞有性繁殖（母源和父源基因组）乳腺细胞卵细胞子宫内胚胎发育无性繁殖（核供体基因组）DNA克隆是特异DNA片段或基因的选择扩增细胞—DNA克隆：利用细胞内的DNA复制机制PCR—DNA克隆：细胞外或体外多聚酶链反应(PolymeraseChainReaction)（一）细胞—DNA克隆实现DNA克隆所采用的方法称为重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）:人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体连接形成重组DNA分子,然后导入适当宿主细胞,使其扩增得到大量相同的DNA片段;或表达相应的基因产物，使宿主细胞获得新的遗传特性。重组DNA技术，兴起于20世纪70年代。基因工程是重组DNA技术的产业化设计与应用。人类实现对基因进行自如地操作、转移和改造的理想，是在限制性核酸内切酶、载体、连接酶和其它修饰酶被陆续发现以后才得以实现.1限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）70年代早期，发现细菌中存在能切割双链DNA的酶，限制进入细菌内的外源DNA，称为限制性核酸内切酶（限制酶）。迄今已从不同细菌中分离了许多种限制酶，其发现和应用促进了重组DNA技术的发展。1）限制酶分类几乎所有原核生物都含有限制酶，根据结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Ⅰ型切点不固定Ⅲ型切割位点在识别位点之外Ⅱ型特异性切点位置可以控制和预测，产生固定的DNA片段，重组DNA技术中所用的限制酶均为Ⅱ型。2）限制酶命名命名原则：根据限制酶来源的微生物学名命名。第1个字母大写（斜体）代表该酶宿主菌的属名第2、3个字母小写（斜体）代表该酶宿主菌的种名第4个字母大写（正体）代表该酶宿主菌的菌株。如果从一个菌株中发现了数种限制酶，根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。从EscherichiacoliRY13中第1个分离的限制性酶EcoRⅠ3）限制酶识别序列限制酶切断DNA分子磷酸二酯键的核酸酶。酶来源切割序列长度kb(人类DNA)HaeIIIHemophilusaegyptusGGCC0.6TaqIThermusaquaticusTCGA1.4HindIIIHemophilusinfluenzaeRdAAGCTT3.1EcoRIEscherichiacoliRfactorGAATTC3.1PstIProvidenciastuartiiCTGCAG7.0SmaISerratiamarcescensCCCGGG78NotINorcadiaotitida-caviarumGCGGCCGC97664）限制酶主要特征（1）特异识别4~8个碱基对，通常为回文序列，即按5′→3′方向阅读，DNA双链碱基顺序相同。（2）切断DNA分子的磷酸二酯键（3）限制片断末端：平末端（bluntends）：切割点在识别序列的对称轴上突出末端（overhangingends）：交错切割DNA5′突出末端3′突出末端突出末端易于通过碱基互补彼此连接，又称黏性末端产生相同突出末端的DNA片段，可有三种方式：①用相同的限制酶②用识别序列相同的不同限制酶即同裂酶(isoschizomers)；③用识别不同序列但产生相同粘性末端的限制酶；如BamHI和MboI。不同限制酶切割产生的限制性片段2、DNA连接酶1967年在三个实验室同时发现一种封闭DNA链上缺口的酶，借助ATP等水解提供的能量催化DNA链的5′-PO4-与另一DNA链的3′-OH生成磷酸二酯键，即DNA连接酶。经限制酶切割和DNA连接酶的作用，将靶DNA序列和载体DNA连接成重组DNA3载体1）载体的定义及其特征（1）载体(vector)定义：将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。①分子量小，以容纳较大的外源DNA；②有多种限制酶单一识别序列，有助于外源DNA片段插入；③载体DNA被切割并插入外源DNA后，不影响其复制能力④有标记基因，有利于筛选重组体。⑤克隆载体上要有复制起点，表达载体上还要有启动子。（2）载体特征根据载体用途分为：克隆载体：克隆的外源DNA片段在宿主细胞中增殖、扩大数量。克隆载体上需有复制起始点.表达载体：克隆的外源DNA片段或基因在宿主细胞中表达产生RNA和/或蛋白质。表达载体上还需有启动子。2）载体分类(1)克隆较小片段DNA的载体：质粒（plasmid）(2)克隆中等大小片段DNA的载体：λ噬菌体（Lambdaphage）粘粒载体（3）克隆大片段DNA的载体：细菌人工染色体（BAC）载体，噬菌体P1载体（4）克隆巨大片段DNA的载体：酵母人工染色体（YAC）。根据克隆片段的大小，分为如下几类(1)质粒（plasmid）细菌中独立于染色体外的双链闭环DNA分子。大小约为数千碱基对。天然质粒需经改造才能适用于DNA克隆*插入多克隆位点：人工合成30bp左右的一段DNA序列，含有多种限制酶的单一切点*插入抗生素抗性基因：如Ampr*建立用于重组子筛选的选择系统，将多克隆位点置于可表达的标志基因中间。能够携载外源DNA分子＜10kb质粒(plasmid)(2)λ噬菌体（lambdaphage）高效感染细菌的病毒DNA分子为线性双链5′末端是12个核苷酸突出的粘性末端，又称cos序列。①置换λ载体:外源DNA片段取代λ噬菌体DNA分子中间部分的基因。插入片段：9-23kb常用于制备基因组DNA文库②插入λ载体:外源DNA片段插入λ基因组的CI基因.插入片段：〈10kb常用于制备cDNA文库(3)粘粒（cosmid）将质粒和λ噬菌体改建的载体，即cos序列插入一小plasmid中所构成.能够携带外源DNA分子约33-44kb。(4)P1噬菌体和P1衍生人工染色体（PAC）P1噬菌体:其DNA为线性，体外包装于蛋白质壳内。P1DNA进入宿主细胞后环化，扩增。携带外源DNA片段约100kb将P1噬菌体和F因子结合构成了PAC，携带外源DNA片段约130-150kb。(5)细菌人工染色体（BAC）是基于大肠杆菌的F因子构建的、低拷贝的质粒载体。（F因子是大肠杆菌中自然存在的一种致育质粒，编码多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质）BAC分子中携带：抗生素抗性标记、复制子oriS、利于DNA复制的解旋酶（RepE）以及确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB等）它不同于一般质粒，能携带外源DNA片段300kb(6)酵母人工染色体（YAC）由着丝粒和端粒的DNA序列和自主复制序列组成的一种载体.在酵母中准确复制插入DNA片段约0.20--2.0Mb。复制大片段的DNA。4细胞—DNA克隆主要步骤主要有以下步骤1）分离纯化目的基因2）构建重组DNA分子3）宿主细胞的转化4）含重组体的宿主细胞的筛选、扩增5）分离重组DNA第一步骤分离纯化目的基因1.化学合成法根据已知序列进行化学合成2.从基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）中获取3.从cDNA文库（cDNAlibrary）中获取4.用聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）合成5从已有重组载体中获得第二步骤：构建重组DNA分子选择适当的载体；将目的DNA和载体DNA分别经某种限制性内切酶消化后，将二者置于一个反应体系，相同粘性末端借氢键互补连接（粘性末端一般为4个核苷酸，氢键比较弱，只能在低温维持）。连接酶（ligase）使两个分子以共价键连接（形成磷酸二酯键），构成重组DNA分子。不仅适用于互补粘性末端，而且适用于平末端的DNA片段连接。第三步骤：宿主细胞的转化（transformation）目的DNA片段与载体连接构成的重组体，导入适当宿主细胞的过程称为转化。感受态细菌（competentcell）细菌细胞膜具有选择通透性，不允许大分子通过。当细菌先暴露于高离子强度溶液(CaCl2)或经短暂电休克等作用后，其通透性增高，部分细菌能从环境中摄入外源DNA，称感受态细胞。转化第四步骤：含重组体的宿主细胞的筛选、扩增将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面：培养基中含有宿主菌敏感的抗生素；载体分子中含有相应抗生素的抗性基因，只有导入载体的细菌才能在培养基上生长；导入的载体是自身环化还是含有目的片断的重组载体，有待进一步筛选。筛选有多种方法，蓝白筛选是其中常用的一种。载体中还含有标志基因-β-半乳糖苷酶基因片段，其产物与缺陷株细菌产生的另一部分半乳糖苷酶产生α互补，使培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)转化为蓝色物质。。多克隆位点（multiplecloningsites,MCS）设计在标志基因内，MCS本身不影响标志基因表达。外源DNA片段插入MCS后，标志基因表达丧失—插入失活。可区分仅含载体的宿主菌（菌落为蓝色）和含重组DNA的菌落（菌落为无色）挑取含重组DNA的菌落，置液体培养基中培养。得到大量含重组DNA的细菌第五步骤：分离重组DNA收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子并纯化。由于一个感受态细菌细胞最初常常仅摄取一个重组DNA分子，纯化的重组DNA分子完全一致，称DNA克隆。通过酶切方法获得目的DNA片段，测序鉴定。细胞IDNA的克隆DNA克隆重组DNA技术操作过程可简单归纳为小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体5DNA文库（DNAlibrary）某一特定来源的DNA通过细胞-DNA克隆技术构建成含有所有DNA片段的重组DNA分子，并转化至细菌内，构成DNA文库。依来源DNA不同基因组DNA文库cDNA文库1）基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）人类所有细胞的核基因组DNA相同，可从易得到的白细胞中制备基因组DNA文库。基因组DNA文库：将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞,在培养基上选择性生长的阳性菌落的集合称基因组DNA文库,简称G－文库。基因组文库具有种属特异性，但无组织特异性2）cDNA文库（cDNAlibrary）不同组织及不同发育阶段的细胞基因表达不同。以来源于特定（类型或发育阶段）组织的mRNA为模板，用逆转录酶合成cDNA；与含有某一种限制酶切点的双链寡核苷酸接头连接后，用该酶切割成粘性末端，与载体连接后转化宿主细胞,由此得到的所有阳性菌落总和,称该组织的cDNA文库.cDNA文库既有种属特异性，也有组织特异性。可从某一特定组织的cDNA文库中分离该组织表达的基因.cDNA文库构建DNA文库意义文库建立后，可从中筛查分离所需的目的基因或cDNA核酸分子杂交：将菌落原位印迹在硝酸纤维素膜上，用同位素标记的特异性DNA探针同膜杂交，放射自显影后可以确定插入特异DNA片段的克隆菌。通过特异性抗体或配体鉴定克隆菌(适于表达性cDNA文库)。cDNA文库6目的基因表达重组DNA技术：1）得到大量相同的目的基因或DNA拷贝（如前所述），用于结构、功能的研究。2）获得目的基因表达产物即RNA或蛋白质-----目