显微镜的使用和细菌的简单染色-浙江工业大学首页

Exerciseone显微镜的使用和细菌的简单染色制作者：黄海婵（[e-mail]）Tel:[phone]or0571-88320057实验内容显微镜介绍油镜的使用原理染色原理目的要求实验原理实验材料实验程序作业显微镜的使用细菌简单染色的流程实验原理——显微镜介绍普通光学显微镜(NIKON)欧林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜麦克奥林生物显微镜显微镜的构造机械装置光学系统镜座载物台镜臂标本夹和标本移动尺粗调螺旋和细调螺旋聚光镜升降螺旋接目镜接物镜及镜头转换器聚光镜虹彩光圈反光镜显微镜的放大倍数和分辨率1.放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数2.显微镜的分辨率是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：D=λ/2n·sin(α/2)式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。：可见光的波长（平均0.55m)n:物镜和被检标本间介质的折射率。：镜口角（即入射角）。实验原理－油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。油浸没物镜介质：左－空气；右－香柏油实验原理－染色剂和染色原理回目录页由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。但是，任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素如：正负离子之间的相互吸引等。实验原理－染色剂和染色原理染色剂染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型：1.酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。2.碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。3.中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。4.单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudanb)的染料。细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。实验原理－染色剂和染色原理微生物染色常用染料如下表：实验原理－细菌的三种基本形态球菌（Sphericalcoccus）:包括双球菌、链球菌、葡萄球菌、四链球菌、八叠球菌等杆菌(Rod-shapedbacillus)：短小、粗大、细长、棒状、分支螺旋菌(Spired-shapedspirallum)：弧菌、螺菌实验材料器材：显微镜、擦镜纸、吸水纸、载波片、盖玻片、接种环、酒精灯、废液缸、洗瓶等。细菌形态的染色标本。菌种：培养12—18h的枯草杆菌（B.subtilis)、大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）染色液和试剂：石炭酸复红、吕氏美蓝、香柏油、二甲苯(或者乙醇乙醚溶液）等-实验程序－显微镜的使用1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。2.调节光亮度3.低倍镜观察：粗调、细调4.依次再进行中倍、高倍观察5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯（或者乙醇乙醚溶液）擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。主要是油镜的使用显微镜保养和使用中的注意事项：1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度，用完油镜必须进行“三擦”。3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。实验程序——细菌简单染色蒸馏水涂片接种环自然干燥固定石炭酸复红(吕式美兰)染色1min水洗干燥擦拭水洗时不要直接冲菌膜每位学生一人一组，取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，各做一块涂片。录像演示染色注意事项1.涂片过程中，去生理盐水和细菌不宜过多，涂菌要均匀，不宜过厚。2.固定时温度不可过高，以载玻片背面不烫手背为宜，因为温度过高会破坏细胞的形态。3.水洗时，不应直接冲洗细菌涂面，水流不应过大、过急，以免细菌涂面被冲掉。错误操作示范实验报告根据观察结果，画出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，并注明菌体染色后的颜色。思考题油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？使用油镜时，为什么必须用镜头油？镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？实验一结束下周实验实验二细菌的革兰氏染色和芽孢染色（书中实验十一和实验十四）球菌肺炎链球菌淋球菌化脓性链球菌金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(division)杆菌破伤风杆菌肉毒芽孢杆菌炭疽杆菌大肠杆菌杆菌变形杆菌大肠杆菌绿脓杆菌螺菌钩端螺旋体幽门螺杆菌霍乱弧菌Spirulinasp.-FilamentousCyanobacterium