第10章 抗原抗体反应

[e-mail]第十章抗原－抗体反应免疫测定Immunoassay,IA郭军MD副教授食品质量与安全教学系[e-mail]一、抗原－抗体反应的特点（体外反应）p176⑴特异性⑵交叉性两种抗原含有共同部分（同抗原决定基）⑶比例相关性/按比性⑷可逆性如提取纯化，亲和层析⑸阶段性第一阶段Ag－Ab特异结合，几分钟第二阶段出现肉眼可见变化：凝集、沉淀、溶解、标记放大。几分钟、几小时～[e-mail]二、影响Ag－Ab反应的因素⑴电解质0.85％NaCl或其他Buffer⑵酸碱度pH6～8⑶温度最适37℃，低温缓慢，室温也可，不高于56℃[e-mail]三、Ag－Ab反应（试验）种类㈠凝集反应agglutinationtest•概念：颗粒Ag与相应Ab结合，在电解质存在下，经过一定时间（几分～几小时）出现肉眼可见的凝集块现象称为凝集反应凝集原凝集素[e-mail]•凝集试验的类型⑴直接凝集反应①试管凝集试验②玻片凝集试验如血型检验、O抗原检验⑵间接凝集试验将可溶性Ag，或者把Ab吸附于不直接参与和干扰Ag－Ab反应的颗粒载体上，然后使二者混合发生凝集反应。⑶协同凝集反应属于间接凝集反应[e-mail]间接凝集反应[e-mail]㈡沉淀反应•概念指可溶性Ag与相应Ab特异结合，形成免疫复合物在电解质影响下形成沉淀现象。沉淀原precipitinogen可溶Ag如细菌浸出液沉淀素[e-mail]•沉淀试验类型⑴环状沉淀试验液体中直接沉淀⑵凝胶沉淀试验/免疫扩散①双向免疫扩散②免疫单扩散③免疫电泳[e-mail]㈢补体结合反应/试验Ag－Ab特异结合后，补体参与下，发生溶菌、溶细胞、溶血现象。溶血素[e-mail]㈣标记抗原－抗体反应/技术免疫标记技术•概念指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金、生物素－亲和素等标记Ab或Ab，后进行的Ab－Ag反应。一抗、二抗（抗抗体）、酶标二抗荧光素、放射性同位素、酶标记最为成熟，称为免疫学三大标记技术[e-mail]•免疫标记技术的优点a特异性强b敏感性高c快速d能定性、定量和定位[e-mail]测定原理ELISA，enzyme-linkedimmunoadsorbentassay酶联免疫吸附试验一种标记抗体/抗原的分析技术[e-mail]种类•夹心法•间接法•竞争法[e-mail]双抗体夹心法（HBsAg、HBeAg等）示意图固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。[e-mail]双抗原夹心法（抗-HBs等）示意图1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗原，则结合为抗原-抗体-酶标记抗原复合物。4.酶催化底物并显色。酶抗原酶标记抗原抗体抗原固相载体[e-mail]酶抗抗体酶标记抗抗体抗体抗原固相载体1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。4.酶催化底物并显色。间接法（抗-HCV等）示意图[e-mail]捕捉法（抗-HAVIgM、抗-HDVIgM等）示意图酶抗体酶标记抗体抗原抗抗体固相载体抗体1.将抗抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗抗体-抗体复合物。3.加入抗原及酶标记抗体，则结合为抗抗体-抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。[e-mail]免疫胶体金技术[e-mail]简介•胶体金作为示踪标志物标记抗原（半抗原）或抗体•目前发展为一种常用的标记技术各种生物学研究中广泛使用。各种食品卫生、安全指标的最快速检测几乎都用免疫胶体金技术。医学诊断使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能用到。[e-mail]免疫胶体金技术的基本原理：还原剂弱碱性蛋白质阳离子基团↓↓↓氯金酸→金颗粒→阴离子胶体→胶体金－蛋白质HAuCl4•胶体金标记物：抗原、半抗原、抗体均可标记多种生物大分子，如SPA、PHA、ConA等。[e-mail]@china.com•免疫金标记技术Immunogoldlabellingtechnique主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。[e-mail]常用的免疫胶体金检测技术：•免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色。•免疫胶体金电镜染色法•斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜（硝酸纤维膜）作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。•胶体金免疫层析法[e-mail]免疫层析－胶体金测试片•将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。[e-mail]@[e-mail]22,2007