氨基酸工艺学第十三章

十三章异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵罗娜第一节分支链氨基酸的生物合成途径和代谢调节机制•支链氨基酸包括L-缬氨酸(L-valine)、L-亮氨酸(L-leuine)和L-异亮氨酸(L-isoleuine),因其疏水脂质链都具有分支的甲基基团,又称之为分支链氨基酸。支链氨基酸作为人体必需氨基酸,不仅是蛋白质的合成原料,而且还具有特殊的生理和生物学功能,亦可作为生物体能源，也作为生物体成分的前体。•PC：磷酸烯醇式丙酮酸酶羧化酶•AK：天冬氨酸激酶•HD：高丝氨酸脱氢酶•TD：苏氨酸脱氢酶•AS：乙酰羟基酸合成酶•HT：高丝氨酸激酶支链氨基酸的合成途径和调节机制第二节异亮氨酸发酵•什么是异亮氨酸？•异亮氨酸（Isoleucine,Ile），又称“异白氨酸”，系统命名为“α-氨基-β-甲基戊酸”。是人体必需氨基酸之一，属脂肪族中性氨基酸的一种。化学式：CH3CH2CH(CH3)CH(NH2)COOH。分子量：131.17。菱形叶片状或片状晶体，味苦。熔点：284摄氏度。溶于水，微溶于乙醇。•L-异亮氨酸的用途•是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要的作用，因此，在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。•食品方面：主要用于食品强化，使各种氨基酸平衡，提高食品的营养价值。•医药方面：3种支链氨基酸组成的复合氨基酸输液以及大量用于配置治疗型特种氨基酸的药物，如肝安、肝灵口服液，对治疗脑昏迷、肝昏迷、肾病等具有显著疗效，并可取代糖代谢而提供能量，是比较昂贵的氨基酸原料药之一。一、L-异亮氨酸的合成途径及调节机制L-异亮氨酸的生产方法•添加前体物发酵法：1•这种是利用葡萄糖作为碳源和能源，再添加特殊前体物质，经过微生物作用将其转化为目标氨基酸的方法。•这种方法可以避免生物合成途径中的反馈调节，但是其前体物质成本太高。•很少用L-异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三种，由于化学合成法产生的异构体难分离，所以目前工厂生产上实施的主要是发酵法，也就是利用微生物的代谢作用，其又包括以下两种：•直接发酵法：2•借助微生物具有合成自身所需的氨基酸的能力，对其进行诱变处理，选育出营养缺陷型或氨基酸类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈阻遏和反馈抑制，从而达到过量积累目的氨基酸的目的。•添加前体物发酵法：1•这种是利用葡萄糖作为碳源和能源，再添加特殊前体物质，经过微生物作用将其转化为目标氨基酸的方法。•这种方法可以避免生物合成途径中的反馈调节，但是其前体物质成本太高。•很少用L-异亮氨酸高产菌应具备的生化特征：•二氧化碳固定反应能力强•天冬氨酸合成酶能力强•天冬氨酸激酶活力强•高丝氨酸脱氢酶活力强•苏氨酸脱氢酶活力强•乙酰羟基酸合成酶活力强•二氢吡啶-2,6-二羧酸合成酶活力微弱或丧失•琥珀酰高丝氨酸转琥珀酰酶活力微弱或丧失•谷氨酸脱氢酶活力弱L-异亮氨酸产生菌的选育方法1、切断或减弱支路代谢2、解除菌体自身反馈调节3、增加前体物的合成4、切断进一步代谢途径一、基于代谢过程的氨基酸工程菌构建的具体思路•代谢过程的具体思路和常规诱变育种技术有所不同•（1）改变代谢流①加速限速反应②构建代谢旁路③改变能量代谢途径④改变分支代谢途径的流量•（2）扩展代谢途径和构建新的代谢途径•①延伸代谢途径•②构建新的生物合成途径二、基于代谢工程策略构建L-异亮氨酸高产菌•氨基酸工程菌的构建策略•1、借助于基因克隆与表达技术，将氨基酸生物合成途径中的限速酶编码基因导入生产菌中，通过增加基因剂量和（或）更换表达调控条件，扩增其表达。导入的限速酶基因既可以是生产菌自身的内源基因，也可以是来自非生产菌的外源基因。•2、采取类似的方法，扩增表达氨基酸输出系统的关键基因，或降低某些基因产物的表达效率，最大限度地解除氨基酸及其生物会合成中间产物对某些生物合成途径可能造成的反馈抑制。•3、将多种完整的氨基酸生物合成操纵子导入另一种氨基酸的生产菌中，构建能同时生成两种甚至多种氨基酸的工程菌。第三节亮氨酸发酵•什么是亮氨酸？•L-亮氨酸，又称白氨酸，化学名为α一氨基异己酸，1819年Proust首先从奶酪中分离得到。后来，Braconnot从肌肉与羊毛的酸水解物中得到其结晶，并定名为亮氨酸。L一亮氨酸是常见十八种氨基酸中的一种，也是人体八种必需氨基酸之一。L一亮氨酸为白色结晶或结晶粉末，是一种非极性氨基酸，味微苦，溶于水，20℃、25℃时溶解度分别为23.7g/L和24.26g/L，乙酸(10.9g/L)、稀盐酸、碱溶液及碳酸盐溶液，微溶于醇(0.72g/L)，不溶于醚。一、L-亮氨酸的生物合成途径及代谢调节机制二、L-亮氨酸生物生产方法•L-亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、添加前体发酵法、直接发酵法等•1、提取法(蛋白水解法)：氨基酸是蛋白质的组成单位，在酸性条件下，将L一亮氨酸含量较高的蛋白质水解，得到各种氨基酸的混合物，经分离、纯化、精致等工序获得L-亮氨酸产品。•2、化学合成法:亮氨酸化学合成法有Storeker、α一卤代酸氨解等方法。虽然化学合成法原理简单，价格低廉，但操作复杂，反应条件苛刻，产物多，产率不高，并且有的方法涉及到有毒物质。化学合成法得到亮氨酸是消旋的DL一亮氨酸，为了得到L一亮氨酸，必须进行光学异构体的拆分。•3、微生物转化法（添加前体发酵法）：利用葡萄糖为发酵碳源、能源，再添加目的氨基酸的前体物，经特定微生物的代谢转化作用将该前体物有效地转化为目的氨基酸。•4、微生物直接发酵法：利用微生物能自身合成L-亮氨酸的能力，通过对出发菌株的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏，达到过量积累L-亮氨酸的目的。三、L-亮氨酸产生菌代谢控制育种策略•1、出发菌株的选择•2、解除反馈抑制和阻遏（实现“三个解除一个改变”）•①解除三种支链氨基酸对生物合成途径上的乙酰羟基酸合成酶等三个共用酶的协同反馈阻遏作用：•②解除L-缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制作用：•③解除L-亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制和阻遏作用：•④改变菌体的正常代谢，使像氨基酸这类的代谢产物大量的积累。•3、减弱或切断支路代谢，并增加前体物的合成•4、切断进一步的代谢途径•5、利用基因工程技术构建L-亮氨酸工程菌第四节缬氨酸发酵•别名名称：2-氨基-3-甲基丁酸白色单斜晶系晶体或结晶性粉末，用乙醇水溶液重洁净者为无色板状或鳞片状结晶。无臭，有特殊苦味。•用途：主要用于食品、调味剂、动物饲料和化妆品的制造及配制复合氨基酸输液、合成多肽药物和食品抗氧化剂等。一、L-缬氨酸的合成途径及调节机制二、L-缬氨酸的生产方法•目前，L-缬氨酸的生产方法有提取法、合成法、发酵法等•1、提取法：动物血粉、蚕蛹及毛发水解液中L-缬氨酸的含量较高，从动物血粉和蚕蛹水解液中，应用离子交换技术从混合氨基酸中分离L-缬氨酸，分离效率高，提取操作简单，生产周期短，但是成本高，不适合于现代化大工业生产。•2、合成法：①由异丁酸与氨生成氨基乙丁醇，再与氰化氢合成氨基异丁腈，然后水解而成。•3、添加前体物发酵法（微生物转化法）：使用葡萄糖作为碳源、能源，再添加特异的前体物质即在氨基酸生物合成途径中的一些合适中间代谢产物，以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸。•4、直接发酵法：借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏作用，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。三、L-缬氨酸生产菌的育种策略•1、出发菌株的选择•2、切断或改变平行代谢途径•3、解除菌体自身的反馈调节•4、增加前体物质的合成•5、切断进一步代谢途径•6、选育营养缺陷型回复突变株•7、利用基因工程技术构建L-缬氨酸工程菌