脂肪酶实验方案

脂肪酶实验方案富集培养基(%):酵母膏0.02,Na2HPO40.35,K2HPO40.15,MgSO4·7H2O0.05,NaCl0.05,橄榄油1.0,pH7.0.溴甲酚紫筛选平板分离培养基(%):牛肉膏0.5,蛋白胨1.0,NaCl0.5,葡萄糖0.3,聚乙烯醇1.0,橄榄油2.5,琼脂1.5;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50mg/100mL)0.4mL,pH6.0,7.0,8.0.种子培养基(%):葡萄糖2.0,(NH4)2SO40.5,K2HPO40.1,MgSO4·7H2O0.05,蛋白胨2.5,橄榄油1.0,pH7.0.发酵培养基(%):蛋白胨2.0,蔗糖0.5,橄榄油1.0,(NH4)2SO40.1,MgSO4·7H2O0.05,K2HPO40.1,pH自然产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30℃,200r/min摇床培养24h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。脂肪酶高产菌株的筛选：（1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按1%的接种量接入50mL发酵培养基中(250mL三角瓶),30℃,200r/min摇床培养48h；（2）上清液的制备：经6000rpm/min离心10min，收集上清液，用0.20μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用；（3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5,30℃条件下,每分钟释放1μmol对-硝基酚(ρ-nitrophenol)所需的酶量,定义为一个活力单位。脂肪酶催化对-棕榈酸硝基苯酯分解产生ρ-nitrophenol,在该过程中不断测定其光吸收值的变化。根据单位时间产生ρ-nitrophenol的量来反应脂肪酶的活力。（本实验采用如下方法：分别向各菌株等量上清液中加入等量过量的对-棕榈酸硝基苯酯，在反应过程中不断测定其光吸收值的变化，根据吸光值变化幅度确定产酶量大小。）[A液:16.5mmol/L的对硝基苯棕搁酸酯(p一NPP)的异丙醇溶液(冷藏，两周内使用)。B液:含有0.4%Trilonx一100和0.1%阿拉伯树胶的50mmol/L的Tris一HCI缓冲液(pH8.0)。测定时，将相应的A液与B液1:9混和，取100ul适当浓度的酶液加人900ul的上述混和液中，混匀，37℃反应10min后，用可见分光光度计(410nm)读取A值。在此反应条件下，对硝基苯的消光系数是1.46x105cm3/mol。1个单位的脂肪酶活力定义为每分钟分解p一NPP并释放出1umol对硝基苯所需的酶量。](ii)平板法：采用三丁酸甘油脂平板鉴定法,鉴定板含2%的三丁酸甘油脂乳化液和2%的琼脂粉。取10μl粗酶液加入鉴定板上各小孔(直径0.20cm)中,特定温度下放置12h后,通过水解透明圈的直径大小来测定脂肪酶酶活性大小。菌株产酶条件的优化碳源对产酶的影响；分别选用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、玉米粉、糊精、玉米淀粉、大豆油、橄榄油为碳源(均为2%)进行发酵,以平板透明圈法测定其产酶情况。氮源对产酶的影响；以2%糊精为碳源,分别选用蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵(均为3%)为氮源进行产酶实验。起始pH值对产酶的影响：1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH调节发酵培养基的初始pH值,分别为4.0,5.0,6.0,7.0,8.0和9.0,在30℃下发酵2d,测定酶活,考察初始pH值对酶活的影响.结果显示,初始pH对产酶的影响很大,该菌株产酶的最佳起始pH值在7.0左右,当pH在9的时候,菌体几乎不生长,产酶下降温度对产酶的影响：优化的培养基,在不同温度下(24,26,28,30℃)摇瓶发酵培养,寻找最佳的发酵温度.菌株060805在28℃下产脂肪酶最多不同Mg2+浓度对产酶的影响；变发酵培养基中Mg2+的浓度,观察不同浓度的Mg2+对产酶的影响脂肪酶的酶学特性温度：脂肪酶酶促反应受温度影响很大,在一定范围内温度升高反应速率加快,一般来讲酶促反应的Q10为1～2。另一方面,温度过高会使酶蛋白变性失活。大多数显示脂肪酶最佳温度范围介于30℃～40℃。（25～55℃范围内以5℃为梯度以分光光度法(下同)测定酶活）PH：脂肪酶的活力受pH影响很大,pH的变化可影响酶活性中心部位活性基团的解离,从而影响到酶与底物的结合或催化底物转变为产物。经调查,大多数脂肪酶最适pH值6～9。（取一定量的纯化酶液与等体积的pH5.0～11.0的各种缓冲液混匀,置于4℃下存放24h后检测酶活(以未处理的酶液作为对照)）热稳定性：取20mL酶液分别置于40、50、60、70℃恒温水浴处理60min,每隔10min取样测定残留酶活力(以未经处理的酶液作对照).（一定量的纯化酶液分别置于不同温度下恒温处理30min(以未处理的酶液为对照)分光光度法(下同)检测其酶活）影响脂肪酶活力的活性因子：肪酶活性的影响因子很多,包括各种金属离子和有机化合物及表面活性剂等物质。Ca2+和Mg2+、Na+、K+和Li+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Ba2+、Fe3+、Zn2+（取一定量的酶液分别与等体积10mmolPL的各种金属离子及不同浓度的表面活性剂混匀,置于4℃下存放24h后测定酶活(以未处理的酶液作为对照)）