RAD teq

RAD标记测序及其在分子育种中的应用背景介绍遗传标记主要有五种类型:形态标记（morphologicalmarker）细胞标记（cytologicalmarkers）生化标记（Biochemicalmarker）免疫学标记(ImmuneGeneticMarkers)分子标记（molecularmarker）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。传统的育种主要依赖于植株的表现型选择(Phenotypiealselection).环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用。利用先进的生物学技术，科学家们可以通过分子标记的方法筛选优良品种。有一些分子标记仅仅是测序，检测单核苷酸多态性，根本不涉及基因调控。背景介绍按其技术原理，可分为三大类：第一类是以分子杂交为基础的标记技术，主要是RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)第二类是以PCR反应为基础的一系列分子标记技术，如RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）；SSR（SimpleSequenceRepeat）等第三类是以酶切和PCR为基础的分子标记技术，主要有AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism）等背景介绍RAD标记限制位点相关DNA（restrictionsiteassociatedDNA，RAD）标记，是全基因组中一种特定的限制性内切酶的每一个酶切位点的代表，已经成为一种基于测序技术的新标记RAD是基于新一代测序的一种快速而且高通量的基因分型技术。不仅节省传统测序的试验成本，而且能快速准确的定位出数以千计的基因标记，从而更加适合分子辅助育种的应用该方法可应用于寻找DNA多态性，能够快速的鉴定出高密度的SNP位点，构建未知基因组序列生物的遗传图谱，定位目的性状基因等，可以广泛应用于群体的遗传学研究。基于基因芯片的RAD标记首先，取某个特定物种的基因组DNA，用1个特定的限制性内切酶来消化。在酶切的片段两端连接上生物素链接器利用其他的酶将基因组DNA任意地剪切成更小的片段这些片段的长度小于特定的限制性酶切位点之间的平均距离，剪切的产物中只有携带了链接器的片段才是可用的当所有酶切后的片段在同一个介质中移动时，用链霉亲和素磁珠来固定携带链接器的片段最后，分离并收集磁珠，再从磁珠上释放目的片段通过标记和杂交的方法来鉴定和定型原始的限制性酶切位点基于二代测序的RAD标记RAD测序技术结合了两种简单的分子生物学技术，Illumina测序技术和分子标记(MID)技术Illumina测序技术利用限制性内切酶把DNA片段切成碎片(就像RFLPs和AFLPs)，对于特殊的个体利用伴随的分子标记(MID)序列来读取。此方法非常适合大的群体研究。RAD测序流程1、DNA提取、Rnase处理酶切处理A来自某特定个体的基因组DNA被特定的限制性内切酶进行剪切，产生1个具有携带粘性末端的片段集合。选用酶切位点平均分布在整个基因组的酶，根据想要获得标记的数量及准确性选择相应的限制性内切酶，每种限制性内切酶构建出的RAD文库都与该限制性内切酶相关。混合B2、P1adapter连接在酶切片段两端加上P1接头，其中P1接头包含三部分：a、限制酶切位点（与酶切片段产生相同粘性末端），起到连接酶切片段作用b、条形码，即一小段DNA序列用于分类样品（将不同性状个体用带有不同MID的P1接头结合，测序之后可以通过MID找到对应初始性状的样本）c、Illumina测序引物位点，能够与Illumina流动细胞相链接物结合的位点3、不同性状个体酶切片段混池4、P1接头DNA片段随机打断在酶切位点和P1接头连接之前，某些基于有利条件的个体片段也有可能合并．这些来自若干个体被标记的限制性酶切片段被合并后，将任意的被剪切成平均长度为几百bp长度的片段C5、胶回收300-500bp、500-700bp片段6、末端修复（将打碎片段末端修复为平末端）7、加“A”（在3‘端加A）D8、连接P2adapterEP2接头有1个分叉的“Y”型结构，导致了链接P2接头的片段不能与P2引物结合，除非其已经通过P1接头完成扩增．这种机制能够确保所有的扩增片段拥有P1接头和MID，包括局部的限制位点、几百bp长度的侧翼序列和1个P2接头.G9、PCR扩增（利用P1和P2的引物进行PCR扩增）F10、Illumina测序将相同MID的基因序列进行聚类，去除冗余序列，找出不同MID间基因序列的差异，通过子代标记信息与父母本标记信息比较，判断子代标记的来源。应用RAD测序对于非模式生物体的遗传分析有很广阔的应用前景，被用于很多的生物学研究方向，包括从大规模的种群基因组中鉴别特定的目的基因，连锁图谱中基因型与表型相联系的遗传图谱的构建，高密度遗传图谱和对未知物种的基因组进行测序。应用在育种中的RAD测序技术，将显著提高复杂性状改良的可操作性和新品种选育的效率，对于分子育种的发展有着十分重要的意义。