49第三章 基因工程载体

生命科学学院第三章基因工程载体第一节克隆载体第二节表达载体第三节其它特殊用途载体生命科学学院本章重点掌握的内容1.掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、α-互补、插入失活、人工染色体载体的概念。2.克隆载体DNA分子具备的条件。3.标记基因的分类及其作用。4.pUC18/19质粒载体的组成、优点及质粒克隆载体用途。5.λ-DNA载体的构建、类型及其优点。6.植物表达载体的组成、启动子的类型等遗传物质+载体重组的DNA分子引入细胞或生物体内复制与表达稳定地遗传给下代生命科学学院生命科学学院基因工程流程图生命科学学院DNA：1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区（encodingregion)和终止子（terminator)的基因，or组成基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的；2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。所以，通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为基因工程载体。生命科学学院载体的概念载体（vector)•是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分；•基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，在很大程度上决定于载体。生命科学学院载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件生命科学学院载体的要求A、复制起点：能在受体中复制；B、筛选标记；C、限制性内切酶切割位点；D、载体的大小：原则上要求载体越小越好；E、适当的拷贝数；F、载体的安全性：质粒不能随便转移;G、外源基因的表达：启动子。生命科学学院pBR322BamHISalIHindIIIPstIScaIAmprori(4.36kb)大肠杆菌质粒载体pBR322结构图复制起点遗传标记基因克隆位点克隆位点生命科学学院载体的分类按功能分类克隆载体克隆一个基因或DNA片断表达载体用于一个基因的蛋白表达整合载体把一个基因插入到染色体组中按来源分类质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体人工染色体载体生命科学学院载体的种类和特征质粒*受体细胞结构插入片断举例E.coli环状＜8kbpUC18/19,T-载体等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状＜10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体＞1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒生命科学学院第一节克隆载体生命科学学院一、质粒载体1.质粒的概念质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA分子—眼虫、衣藻等）双链DNA分子（酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自身复制和表达。并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力（带有抗性基因等）。分子量在1-200kb之间。生命科学学院一、质粒载体大肠杆菌的质粒生命科学学院一、质粒载体2.质粒的空间构型①共价闭合环状DNA（CovalentclosecircularDNA，cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）生命科学学院一、质粒载体②开环DNA（opencircular，ocDNA）一条链上有一至数个缺口。③线形DNA（linear，LDNA）生命科学学院生命科学学院一、质粒载体同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：SCDNA最快、LDNA次之、OCDNA最慢。SCOCL生命科学学院一、质粒载体3.质粒的基本特性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒（stringentplasmid）(拷贝数少，为1-5个)和松弛型复制控制的质粒（relaxed）(拷贝数多，可达10-200个拷贝)因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB115～20pUC系列质粒及其衍生质粒突变的pMB1500～700pSC101及其衍生质粒pSC101～5ColE1ColE115～20生命科学学院一、质粒载体质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相同的复制子。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容生命科学学院一、质粒载体质粒的可转移性接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用。值得注意的是，某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由mob、tra基因顺式因子bom及其内部的转移缺口位点nic决定。生命科学学院一、质粒载体TraproteinfromconjugativeplasmidbomsiteMobgenemobmRNAMobproteinrecipientcellhelperplasmid即mob基因的产物可打开非接合质粒的oriT位点，借助接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用(mobilization)。质粒的可转移性生命科学学院一、质粒载体大肠杆菌接合（conjunction）质粒DNA的tra基因E.Coli产生菌毛宿主与受体细胞结合遗传物在细胞之间转移（指令）（迁移）生命科学学院一、质粒载体携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义生命科学学院一、质粒载体遗传标记基因定义:在基因工程中使用与选择重组体DNA转化细胞的基因标记基因的作用1.指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞2.指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子生命科学学院一、质粒载体标记基因的种类1.抗性标记基因（可直接用于选择转化子）a.抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr，Neorb.重金属抗性基因:Cur，Znr，Cdrc.代谢抗性基因:TK，抗除草剂基因2.营养标记基因（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3.生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ，GUS，CAT4.噬菌斑生命科学学院一、质粒载体生命科学学院一、质粒载体抗药性标记选择(插入失活法)生命科学学院一、质粒载体常用的遗传标记基因β-半乳糖苷酶基因（lacZα和lacZβ）β-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β-半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145AAs)。这两个基因（LacZα和LacZβ）均可作为标记基因。β-半乳糖苷酶基因的优点:a.酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观b.lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性c.lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大生命科学学院一、质粒载体PLacZαLacZβ转录翻译αβ常用的遗传标记基因LacZ基因的结构与产物生命科学学院一、质粒载体lacZβ-半乳糖苷酶分解半乳糖iPO调控蛋白P大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统生命科学学院一、质粒载体lacZ-β-半乳糖苷酶-分解半乳糖iPO调控蛋白Pα-肽段分解X-gal产物呈现蓝色诱导剂IPTGa-互补显色反应（蓝白斑筛选）β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15生命科学学院一、质粒载体X-galX-gal-peptideC-terminusofb-galactosiase+生命科学学院一、质粒载体互补显色反应生命科学学院一、质粒载体α-互补(α-complementation)生命科学学院一、质粒载体常用的遗传标记基因葡萄糖苷酸酶基因（GUS）该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。荧光素酶基因荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。发光蛋白质基因发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。生命科学学院一、质粒载体4.质粒的命名原则人工组建的质粒人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。如pBR322，字母p代表质粒，BR是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表…构建的一系质粒的编号。生命科学学院一、质粒载体5.质粒载体的发展概况第一阶段（1977年前）天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,ColE1,pCR,pBR313和pBR322。第二阶段增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。第三阶段完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。生命科学学院一、质粒载体6.质粒载体构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC1018.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Ampr生命科学学院一、质粒载体第一个用于基因克隆的天然质粒,克隆位点少，Tetr作为筛选标志。生命科学学院A、删除不必要的DNA区域:尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。B、减少限制性酶切点:缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接酶的共同作用，机械破碎和质粒之间的重组等方法。C、加入易于识别的选择标记：通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。D、安全性能改造：质粒载体不能在细菌之间随便转移。E、改造或加入基因表达的调控序列：启动子。质粒的改造生命科学学院一、质粒载体7.质粒载体的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000扩增基因低拷贝质粒来自pSC101拷贝数小于10表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接