真菌学检验

真菌学检验1病原真菌学概论4真菌门接合菌亚门毛霉、根霉子囊菌亚门酵母担子菌亚门鹅膏菌半知菌亚门表皮癣菌、隐球菌一、真菌的分类5二、真菌与人类的关系在自然界中分布广泛，约二十余万种，对人致病的约150种。6对人致病性的真菌分为：病原性真菌条件致病性真菌产毒真菌致癌真菌7真菌是医院感染常见微生物院内感染的——7.5%-15%血液感染的——第四位肿瘤病人发病率——为8%严重创伤、烧伤病人——高达16%病死率——达55%-70%•条件致病菌感染——呈上升趋势，为继发性感染（呼吸道、皮肤、消化道粘膜损伤）8真菌（fungus）属真菌界,真核细胞型微生物。典型的细胞结构无根、茎、叶，不含叶绿素。腐生或寄生方式摄取营养。细胞壁含几丁质（chitin）、纤维素。有性和（或）无性繁殖。三、真菌的基本特性9真菌的形态特性真菌单细胞：酵母型（yeast）、类酵母型（yeast-like）圆、卵圆，出芽方式繁殖新生隐球菌，白假丝酵母菌多细胞：霉菌型(mold)菌丝(hypha)、孢子(spore),交织成团，称丝状菌癣菌、霉菌10出芽生长11单细胞真菌呈圆形，以出芽方式繁殖，芽生孢子成熟后脱落成独立个体二相性真菌（dimorphicfungus）：某些真菌，可因环境条件改变，由一种形态转变成另一种形态，在体内或含动物蛋白的培养基上37℃培养时呈酵母型，在普通培养基上25-28℃培养时呈霉菌型，如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生菌。12菌丝按有无横隔有隔菌丝按生物学功能菌丝体营养菌丝体气中菌丝体无隔菌丝生殖菌丝体孢子有性孢子由同一菌体或不同菌体上的二个细胞融合形成多为非致病性真菌无性孢子叶状孢子芽生孢子隐球菌、念珠菌厚膜孢子新生隐球菌关节孢子分生孢子大分生孢子小孢子菌属，表皮癣菌属小分生孢子毛癣菌属孢子囊孢子菌丝末端形成膨大的囊状结构，孢子囊，内含众多孢子根霉菌13菌丝按结构可分为：有隔菌丝与无隔菌丝（1）有隔菌丝：大部分真菌的菌丝在一定间距见有横隔，称隔膜。将菌丝分成一连串的细胞。菌丝中无横隔将其分段，整条菌丝就是一个细胞。在一个细胞内含有许多核，是一种多核单细胞。（2）无隔菌丝：16孢子(spore)：孢子是真菌的繁殖器官，一条菌丝上可长出多个孢子。在环境条件适宜时，孢子又可发芽生出芽管，发育成菌丝体。孢子分有性孢子和无性孢子两大类：有性孢子——由同一菌体或不同菌体上的两个细胞融合而成。无性孢子——由菌丝上的细胞分化生成，并不发生细胞融合，包括：分生孢子、叶状孢子和孢子囊孢子。19（1）分生孢子（condium）由生殖菌丝末端细胞分裂或收缩形成，也可在菌丝侧面出芽形成，有两种：大分生孢子（macrocondium）：多细胞组成，梭状、棍棒状；小分生孢子（microcondium）：单细胞组成。（2）叶状孢子（thallospore）：芽生孢子——出芽形成；厚膜孢子——胞浆浓缩，胞壁增厚而成；关节孢子——菌丝胞壁增厚，形成链状排列的长方形节段。芽生孢子关节孢子厚膜孢子（3）孢子囊孢子（sporangiospore）：菌丝末端膨大成囊状，内含许多孢子。23真菌菌落特性酵母型菌落：单细胞真菌的菌落，较大，光滑、湿润、柔软、边缘整齐。霉菌型菌落：多细胞真菌的菌落，棉絮状，绒毛状，粉末状、产生色素。如皮肤癣菌。2425真菌感染的实验诊断261.临床标本的采集临床标本的类别皮肤的角质性物质；各种分泌物和排泄物；血液和体液；脓汁及渗出物。27采集标本注意事项1、采集的标本要适宜：不同真菌感染应采取不同的临床标本。2、用药前采集标本：3、采集的标本量要足：血液和脑脊液5ml，胸腔液20ml4、严格无菌操作：5、采集的标本立即送检：28二、真菌学检验直接镜检：形态学检查是重要依据抗原的检测：分离培养与鉴定：核酸检测：毒素检测：29真菌标本直接检查1.直接镜检：方法简便，快速10%KOH微加热低倍/高倍镜检查有无菌丝/孢子角质标本（皮肤癣菌）直接观察/染色后观察30标本直接检查显微镜检查不染色KOH10~20%致密难以透明毛发、指（趾）甲、鳞屑生理盐水观察出芽现象染色检查革兰染色G+酵母菌、白色念珠菌乳酸酚棉蓝菌丝、孢子皮肤癣菌墨汁染色用于有荚膜的真菌新型隐球菌瑞氏染色骨髓、外周血荚膜组织胞浆菌荧光染色吖啶橙和KOH染色培养涂片、组织切片313233直接镜检评价阳性结果意义1.有诊断意义；2.代表组织相、确定某些致病性真菌属或种；3.判断某些真菌种的致病性等34直接镜检局限性1.阴性结果不能排除真菌感染;2.有假阳性结果。35采用免疫学方法检测真菌抗原，常用的方法有胶乳凝集试验、ELISA、半定量放射免疫测定法。2.抗原检测:363.分离培养真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法;培养成功与否与采集的标本是否适当、是否新鲜、培养基的选择、培养温度与时间等有关;二相性真菌培养37常用培养基及用途培养基名称用途沙氏培养基（Sabourand）用于深浅部真菌的常规培养玉米粉聚山梨酯80琼脂观察白色念珠菌的厚膜孢子马铃薯葡萄糖琼脂脑心浸膏琼脂（BHI）沙比（Sabhi）观察真菌菌落的色素、鉴别深部真菌，使二相型真菌呈酵母型尿素琼脂刺激真菌孢子形成血琼脂多数病原性真菌皮肤真菌实验培养基（DTM）分离皮肤真菌38平皿培养：只能培养生长繁殖较快的真菌;大试管培养:用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种的保存;玻片培养(微量、小培养):可用于真菌菌种的鉴定。39观察菌落形态应注意：1、菌落的性质：酵母菌还是霉菌；2、菌落的大小：病原性真菌菌落小，条件致病性真菌则大；3、菌落颜色：病原性真菌色淡，污染性真菌色深；4、致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂，污染性真菌菌落不下沉，很少引起培养基开裂。40真菌鉴定全面生化反应、分子生物学鉴定，必要时将菌种送有关单位鉴定。检验真菌常用的生化反应有糖(醇)类发酵试验、同化碳源试验、同化氮源试验或利用硝酸钾试验、牛乳分解试验、酚氧化酶试验、明胶液化试验和脲酶试验等。试验方法同细菌试验，主要用于检验深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。41分类根据侵犯的部位不同分为：浅部感染真菌深部感染真菌42浅部感染真菌43定义：侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织。分类：皮肤癣真菌(临床最多见）表皮感染真菌皮下组织感染真菌44侵犯皮肤、毛发、指甲等角蛋白组织引起癣症（发癣、体癣、甲癣等），分三属，约45种皮肤癣真菌45皮肤癣菌的特征属名种数侵犯部位形态特征皮肤指甲毛发大分生孢子小分生孢子菌丝毛癣菌属21+++细长、棒形、壁薄，少见或无梨形、棒形，较多见螺旋状、鹿角状、结节状、球拍状、破梳状，单纯细菌丝小孢子癣菌属15+-+纺锤形，壁较厚，较多见棒形，卵圆形，较少见球拍状及破梳状菌丝表皮癣菌属1++－梨形、壁较薄，多见无单纯菌丝47毛癣菌属48菌落蜡状，开始为白色继续培养呈灰黄或深褐色、皱折。有大、小分生孢子、厚孢子。表皮癣菌属49菌落棕黄色，扁平至放射状皱折、粉状或绒状，反面黄褐色。棒状壁光滑大分生孢子，陈培养中厚孢子增多。小孢子菌属50生长快，菌落浅黄褐色、粉末或绒毛状，反面黄橙色；梭形厚壁大分生孢子皮肤癣真菌引起癣症的特点：接触传染同种皮肤癣菌可在不同部位引起病变相同部位的病变也可由不同的皮肤癣菌引起（如灰指甲可由毛癣菌或表皮癣菌引起）51红色毛癣菌5253甲癣54微生物学检验1、标本采集：70%乙醇消毒552、直接镜检：10%KOH（皮屑）；25%KOH或NaOH+5%甘油（指甲）；透明、有隔、有分支的菌丝及成链的关节孢子发外型感染或发内型感染5657断发毛癣菌引起的发内型感染的头发疣状毛癣菌感染的大孢子发外型感染的头发犬小孢子菌引起的小孢子发外型感染的头发583.分离培养与鉴定标本处理及培养：皮屑、甲屑和病发标本，用70%乙醇处理，接种在沙氏琼脂斜面，25℃培养，直至第四周。挑菌落镜检菌丝和孢子。鉴定试验：如毛发穿孔试验、脲酶试验等。59被石膏样毛癣菌穿孔的毛发60花斑癣其它浅部真菌61糠秕马拉色菌着色真菌62花瓶型分生孢子孢子丝菌6364孢子丝菌深部感染真菌65定义：能侵袭深部组织和内脏及全身的真菌.主要致病菌：假丝酵母菌隐球菌曲霉菌毛霉菌组织胞浆菌卡氏肺孢菌66一、假丝酵母（Candida）俗称念珠菌，有81种，11种对人致病；引起女性的假丝酵母菌性阴道炎、外阴炎。男性念珠菌龟头炎、包皮炎。体弱婴儿鹅口疮；假丝酵母菌性肠炎、肺炎等。AIDS最常见并发症之一。白假丝酵母菌皮肤黏膜感染（鹅口疮）67微生物特性：圆形或卵园形；出芽方式繁殖，在组织内可见芽生孢子、假菌丝；•培养特性：典型类酵母型菌落，表面光滑，呈灰白色或奶油色，有酵母气味。•涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。68假菌丝(pseudohypha):指酵母菌菌种进行一连串的芽殖后，长大的子细胞仍不脱落分离，并继续出芽，细胞成串排列，在分隔处缢缩,这种菌丝状的细胞串就称为假菌丝。微生物特性：在玉米粉培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。70厚膜孢子形成试验微生物检验1、标本直接检查：a、直接显微镜检查：G＋b、抗原检测：ELISA、免疫印迹c、核酸检测：PCR扩增其DNA后以分子探针检测。712、分离培养与鉴定①沙氏培养基，25℃或37℃培养1-4d，可见奶油色菌落。镜检可见假菌丝和芽生孢子。722、分离培养与鉴定②芽管形成试验：细菌接种在0.2-0.5ml人或动物血清，37℃1.5-4h可见芽管；设立阴性对照。73C.albicans(green)白念C.tropicalis(blue)热带C.parapsilosis(white)近平滑C.glabrata(pink).光滑/克柔产色培养基743、药物敏感试验：对二性霉素B、5-FC敏感，但对后者易耐药；4、抗体检测：ELISA、免疫酶斑点试验测抗原或用乳胶凝集、对流免疫电泳试验测抗体；5、动物试验：1ml菌悬液注射兔耳静脉或0.2ml菌悬液注射鼠尾静脉，观察5-7d，剖检。脏器多种小脓肿即为白假丝酵母菌感染。75二、隐球菌隐球菌属，17个种，7个变种。广泛分布于自然界，也可存在于人的体表、口腔和肠道。外源性感染，经呼吸道侵入。侵犯肺、脑、脑膜，也可侵犯皮肤，骨和关节。在国外，是AIDS的最常见并发症之一，是AIDS死亡的首要原因。在我国已被列为乙类传染病。致病物质为荚膜。76电镜下新生隐球菌的荚膜77微生物特性圆或卵圆形、4-6μm，有荚膜，较菌体大1-3倍。78微生物学检验1、标本直接检查（1）直接镜检:墨汁负染，PAS染色（2）抗原检测：乳胶凝集试验、ELISA、单克隆抗体法（3）核酸检测：PCR探针、DNA探针79（新生隐球菌的酵母被一个很宽的荚膜包围）脑脊液的印度墨汁染色标本802、分离培养与鉴定（1）分离培养：沙氏培养基25℃和37℃，2-5d观察。非致病性隐球菌在37℃不生长。（2）鉴定：A、酚氧化酶试验：棕黑色菌落B、脲酶试验：培养基由黄转粉红色C、糖同化及发酵试验：同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖和肌醇，但不发酵糖类、不同化硝酸盐。非致病性隐球菌不同化肌醇。81新生隐球菌菌落粘液样新型隐球菌在血琼脂上生长（发亮的表面是由于酵母形成而产生大量的荚膜多糖）82小结1、真菌的分类、微生物学特征。2、真菌的微生物学检查主要有：标本直接涂片镜检、分离培养和鉴定；3、浅部感染真菌直接镜检的标本处理方法；4、深部感染真菌：（1）白假丝酵母菌芽管形成试验，厚膜孢子形成试验；（2）隐球菌印度墨汁负染色镜检。83思考题1.常见致病性真菌的有哪些种类？2.常见致病性真菌的基本生物学性状及鉴别要点？3.二相性真菌，芽管形成试验，厚膜孢子形成试验概念84