分子生物学技术-分子克隆

研究生科研基本训练——常用实验基本技术生物化学与分子生物学系肖鹏[e-mail]生物医学研究常用基本技术•分子克隆技术（DNA重组技术）•免疫印迹技术（Westernblot）•免疫组织化学技术（免疫组化）•细胞培养技术局限性联合应用分子克隆技术DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法将感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。•基本过程分、切、连、转、筛1.分：分离出要克隆的目的基因及载体。①目的基因的来源：直接分离适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病毒DNA的提取分离。首先通过组建几种限制性内切酶的物理图谱进行基因定位，然后用DNA的酶切片段电泳分离DNA，应用相应DNA探针确定目的DNA后，从胶中回收DNA。(适合原核)人工合成序列明确的短DNA片段，可用DNA合成仪合成（适合较短的）。由mRNA逆转录合成cDNA细胞总RNA分离mRNA分离目的基因mRNA的纯化cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成cDNA的克隆从基因组文库中筛选目的基因首先构建基因组文库（G文库）或cDNA文库（C文库），需要时利用探针技术将所需目的基因“钓”出来。②载体：可容忍外源性DNA片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DNA分子。理想的质粒克隆载体应具有的特性：能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点(MCS,multiplecloningsites)，便于进行克隆分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、α-互补显色反应（蓝白斑筛选）表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，增强子等调控元件生物安全性好目前常用的载体有质粒、噬箘体、病毒等。载体2.切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。3.连：将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接。4.转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细胞）。5.筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。•RNA的提取和cDNA合成•聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段•质粒DNA的分离、纯化和鉴定•质粒、PCR产物的酶切•重组DNA的连接•重组质粒的转化及筛选•凝胶电泳•测序技术DNA体外重组技术总RNA制备•Trizol法:主要用途：总RNA提取（DNA、蛋白质提取）主要成分：苯酚、异硫氰酸胍等适用组织：人类、动物、植物、微生物的组织，细菌或真菌样品量：从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。InvitrogenTRIzol®产品•RNA提取试剂盒：国产、进口常用总RNA提取试剂盒尽量选用含DNA酶的试剂盒Trizol法提取总RNA步骤•以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。•研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，静置3分钟。•取上层水相于一新的离心管，按每1mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。•弃去上清液，按每1mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。•小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。Tips：•样品收集后迅速放入液氮；•样品在Trizol溶液中相对稳定；•注意避免RNase，尤其是内源的；丰度低的mRNA：实验所需的耗材需要0.1%DEPC水处理，高压灭菌丰度中等以上的mRNA：耗材高压灭菌即可。•获得高纯度RNA，要懂得取舍；上清取适量即可（500ul）。•完全干燥的RNA溶解度极低；完全干燥的RNA呈透明状；趁RNA沉淀仍然呈白色的时加水溶解•RNA样品相关实验要尽快进行，如需保存RNA，需存于-80度超低温冰箱；避免RNA酶污染•由于RNA分子容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。•在cDNA生成之前，也就是RNA提取和逆转录过程中都要避免RNA酶污染。•DEPC（diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。•实验用品用0.1%DEPC水处理（2h），高压蒸汽灭菌后烤干备用或购买经过处理的无RNA酶实验用品。•操作过程中带手套、口罩。避免RNA酶污染RNA模板单链DNADNA-RNA杂化双链逆转录反应（cDNA合成）•逆转录（reversetranscription）：是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。逆转录反应体系的基本成分•模板:组织或培养细胞总RNA。•逆转录酶：AMV:禽类成髓细胞性白血病病毒M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒•引物:oligodT,randomprimer，GSP等。•RNA酶抑制剂•底物：等浓度的四种dNTP•反应环境:缓冲液（RTbuffer）可单独购买或逆转录试剂盒Tips：•RNA质量要好；无降解•RNA样品应加热变性处理；RNA65oC处理5min，随后迅速置于冰上，打开二级结构这一步不加任何反应组分•反应中RNA模板量要合适；太多？太少？PCR技术•PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。•一种选择性体外扩增DNA的方法.•一种将微量的目的DNA片段在体外快速、大量扩增的技术。•半保留复制KaryMullis1993年诺贝尔化学奖•三个基本步骤:•(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链;•(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对•(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.•由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达数百倍。PCR反应体系的基本成分•模板:双链或单链DNA•引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷酸片段，一般18-30bp,上下游引物•DNA聚合酶:如Taq酶（Thermusaquaticus）•底物:等浓度的四种核苷酸（dNTP）•反应环境:含有Mg2+的Tris-Cl缓冲液。含DNA聚合酶的2×反应混合物•模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增,模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).•就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.PCR反应体系的基本成分•引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷酸片段，一般18-30bp,上下游引物PCR反应体系的基本成分浓度:0.1umol～１umol/L6×1012～3×1013[Primer]↑错配率↑非特异性产物↑引物二聚体↑引物设计原则引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。引物中G+C含量通常为40%-60%四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构两引物之间尤其在3'端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基引物的选择与设计•从文献中查找•利用引物设计软件获得：如Primer在线软件•Blast分析NCBIBLASTNucleotideblast•直接找•TaqDNA聚合酶：TaqpolymeraseThermusaquaticus5‘→3’DNA聚合酶活性以及5‘→3’核酸外切酶活性无3'→5'核酸外切酶活性致命弱点：出错率高LATaqpolymerase,PrimeStarDNApolymerase,PfuDNApolymerase，FastPfuDNApolymerase•dNTP：dATPdUTPdCTPdGTP一般反应中每种dNTP的终浓度为200~250μmol/L。4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。PCR反应体系的基本成分•含Mg2+的反应缓冲液：Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。PCR反应体系的基本成分浓度:1.０～４.5mmol/L[Mg2+]↑——Product特异性↓[Mg2+]↓——Product特异性↑Vary[Mg2+]instepsof0.5mM.PCR体系的建立25or50lsinamicroEppendorf(0.2ml)tubePCR反应的条件•预变性：94℃，5min•变性：94℃,30s,模板DNA变性成为单链•退火：Tm-5℃,30s，引物与模板DNA结合•延伸：72℃，与扩增片段长度有关，1Kb,1min；1Kb,延长时间•循环数：25-35，平台期之前。•最终延伸：72℃，10min。3-4hoursUVvisualisationThefinalproductTips：•反应体系混匀；•正负对照必须有；•反应条件可以尝试梯度，且只改变一个变量；•根据实验需求选择相应品牌的DNA聚合酶MasterMix;带Loading的Mix；快速的；保真的；RT-PCR•定义：将RNA的逆转录反应（ReverseTranscription）和cDNA的聚合酶链扩增（PolymeraseChainReaction）联合应用的一种技术。•目前对目的基因的mRNA表达进行定性和半定量分析的最常用方法。RT-PCR步骤•提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。RNA提取逆转录反应：经逆转录将RNA逆转录成cDNAPCR：以cDNA为模板，PCR扩增合成目的片段。琼脂糖凝胶电泳RT-PCR应用•用途:1.获得目的基因全长编码序列，用于基因克隆2.检测目的基因mRNA表达水平（定性、半定量）•优点：简单、敏感、便宜•局限性：不能准确反应基因表达状况RT-PCR/Q-PCR（Real-timeQuantitativePCR）RT-PCR检测mRNA表达水平结果分析保证内参照均一的情况下，比较目的条带常用的内参有GAPDH、β-Actin等