细胞生物学实验之(精)

细胞生物学实验之细胞凋亡的检测南开大学生命科学学院二零零七年六月实验目的细胞凋亡的检测——了解细胞凋亡的检测方法加深对细胞凋亡现象及本质的理解练习从形态学角度评价细胞凋亡掌握荧光显微镜的使用方法细胞凋亡的检测——实验原理基本概念：细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀现象。或者说在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。由于这种死亡方式是由基因调控的死亡过程，因此又称之为程序性细胞死亡(ProgrammedCellDeath)。细胞凋亡有别于细胞坏死。似秋叶的凋零，告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡;危难中的细胞啊，你沉稳不乱，DNA片片切割，化云梯直通天堂；细胞体分团相聚，把生命的凝重浓集在小体上；分别了朝夕相处的伙伴，再见了快乐美好的时光；这一切的一切又融入临近的胞体，腾出的空间再写生命的篇章。细胞凋亡与细胞坏死的区别—————————————————————————————————————————————————————————坏死凋亡1.性质2.诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生3.生化特点4.形态变化6.DNA电泳5.炎症反应7.凋亡小体8.基因调控被动过程，无新蛋白合成，不耗能主动过程，有新蛋白合成，耗能细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩弥散性降解，电泳呈均一DNA片状DNA片段化（180-200bp），电泳呈“梯”状条带溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应有病理性，非特异性生理性或病理性，特异性无有无细胞凋亡的形态特征（1）凋亡的起始；微绒毛的消失，细胞间接触的消失，与周围的细胞脱离，细胞质中，线拉体大体完整，染色质固缩（2）细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面（3）凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜所包围（4）凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。细胞凋亡的形态学特征细胞凋亡与疾病细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元退行性疾病，病毒感染细胞凋亡检测方法基于形态学观察的染色法基于DNA片断化的检测法膜联蛋白检测法Caspase酶分析法流式细胞仪定量分析法细胞凋亡的检测——实验原理细胞凋亡的检测——实验仪器、材料及试剂1、仪器、用具：荧光显微镜、显微载玻片、盖玻片、微量2、培养的细胞材料：HeLa细胞3、试剂：吖碇橙/溴化乙锭（AO/EB)的PBS溶液：PBS溶液中分别加入100µg/mL的AO与100µg/mL的EB，配成两种溶液，用时再混合。磷酸盐缓冲液（PBS)：800mL蒸馏水中溶解8gNaCL、0.2gKCL、1.44gNa2HPO4、0.24gkH2PO4，用盐酸调pH到7.4，加水定容到1L。高压灭菌保存。移液器、高压灭菌锅、细胞培养用具细胞凋亡的检测——实验步骤（1）Hela细胞贴壁生长于DMEM培养液中含10%胎牛血清，置37℃5%CO2培养箱中培养2~3天，待细胞形成单层融合状态。（2）去细胞培养液，加入0.215mol/L双氧水的10%胎牛血清培养液中，继续培养24~36小时。（3）收集细胞：用细胞消化液消化细胞使细胞脱壁，制成单细胞悬液。1000Xg离心力离心5分钟，弃上清。（4）取25μl培养的细胞悬液滴于载玻片上，稍风干后，加入AO/EB1:1混合液染色，并盖上盖玻片。（5）荧光显微镜下观察。细胞凋亡的检测——注意事项1、EB为强诱变剂，使用时要注意防护2、试剂与细胞孵育完毕后，要立即检测3、正确使用显微镜，保护好镜头和滤光片细胞凋亡的检测——课后作业及思考1、练习用AO/EB法检测凋亡的细胞，掌握荧光显微镜的使用2、查阅相关文献，理清细胞凋亡与细胞坏死的区别3、了解其它可用于细胞凋亡检测的方法及其原理1、了解细胞凋亡的最新研究进展，结合自己的知识预测未来细胞凋亡的研究方向2、你认为对细胞凋亡机制的深入研究，会对生命科学和医学带来何种影响细胞凋亡的检测——课后作业及思考???