离子交换层析原理..

第五章离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。离子交换层析具有灵敏度高，重复性、选择性好，分析速度快等优点，是当前最常用的层析法之一。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。第一节基本原理在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。同时它与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合，结合后不改变本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。离子交换剂特性离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要是以离子交换方式进行。所进行的离子交换反应是可逆的。假定以RA代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+可发生可逆的交换反应，反应式为：RA+B+→RB+A+该反应能以极快的速率达到平衡，平衡的移动遵循质量作用定律。离子交换反应示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，结合力的大小取决于离子交换剂的选择性。离子交换剂的选择性可用其反应的平衡常数K表示：K＝[RB][A+]/[RA][B+]如果反应溶液中[A+]等于[B+]，则K＝[RB]/[RA]。若K1，即[RB][RA]，表示离子交换剂对B+的结合力大于A+；若K=1，即[RB]＝[RA]，表示离子交换剂对A+和B+的结合力相同；若K1，即[RB][RA]，表示离子交换剂对B+的结合力小于A+。K值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性参数，故称K值为离子交换剂对A+和B+的选择系数。影响离子交换选择性的因素水合离子半径：半径越小，亲和力越大；离子化合价：高价离子易于被吸附；溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，不但影响交换容量；对交换选择性影响亦大。离子强度：越低越好；有机溶剂：不利于吸附；交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少；树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；如Na+Ca2+Al3＋Si4＋。如原子价数相同，交换量则随交换离子的原子序数的增加而增大，如Li＋Na＋K＋Pb＋。在稀溶液中适用。在稀溶液中，强碱性树脂的各负电性基团的离子结合力次序是：CH3COO–F–OH–HCOO–Cl–Br–CrO42–NO2–I–C2O42–SO42–柠檬酸根。弱碱性阴离子交换树脂对各负电性基团结合力的次序为：F–C1–Br–=I–＝CH3COO–MoO42–PO43–AsO43–NO3–酒石酸根柠檬酸根CrO42–SO42–OH–。1、竞争；2、增加蛋白质的水合作用，降低吸附和交换速度。两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力，主要决定于它们的理化性质和特定的条件下呈现的离子状态。当pHpI时，能被阳离子交换剂吸附，反之，当pHpI时，能被阴离子交换剂吸附。若在相同pI条件下，且pIpH时，pI越高，碱性越强，就越容易被阳离子交换剂吸附。离子交换层析就是利用离子交换剂的荷电基团，吸附溶液中相反电荷的离子或离子化合物，被吸附的物质随后为带同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱。由于各种离子或离子化合物对交换剂的结合力不同，因而洗脱的速率有快有慢，形成了层析层。离子交换机理A+自溶液中扩散到树脂表面A+从树脂表面进入树脂内部的活性中心A+与RB在活性中心上发生复分解反应解吸附离子B+自树脂内部扩散至树脂表面B+离子从树脂表面扩散到溶液中交换速度的控制步骤是扩散速度，不同的分离体系可能由内部扩散或外部扩散控制影响交换速度的因素颗粒大小：愈小越快交联度：交联度小，交换速度快温度：越高越快,与扩散系数增加有关离子化合价：化合价越高，扩散速度小离子大小：越小越快搅拌速度：在一定程度上，越大越快溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越快离子交换层析的基本原理若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度有差异，选用适当的洗脱液可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。++++++———++++++++++1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：梯度缓冲溶液先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用第二节离子交换剂的分类及性质一、离子交换剂的类型根据离子交换剂中基质的组成及性质，可将其分成两大类：疏水性离子交换剂和亲水性离子交换剂。(1)疏水性离子交换剂是一种与水亲和力较小的人工合成树脂，最常见的是由苯乙烯与交联剂二乙烯苯反应生成的聚合物，在此结构中再以共价键引入不同的电荷基团。由于引入电荷基团的性质不同，又可分为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂及螯合离子交换树脂。①阳离子交换剂：阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电，可与溶液中的阳离子或带正电荷化合物进行交换反应。依据电荷基团的强弱，可分为强酸型(带磺酸的基团，R－SO3H)、中强酸型（含磷酸基团或亚磷酸基团，R－PO3H2）及弱酸型（带羧基和酚基的树脂，R－COOH或R－苯环－OH）三种。这些交换剂在交换时，氢离子为外来的阳离子所取代，如下式所示：R－COOH＋Na+＝R－COONa＋＋H+②阴离子交换剂此类交换剂是在基质骨架上引入季胺[-N(CH3)3]、叔胺[-N(CH3)2]、仲胺[-NHCH3]和伯胺[-NH2]基团后构成的。依据胺基碱性的强弱，又可分为强碱性(含季胺基)、弱碱性(含叔胺、仲胺基)及中强碱性(既含强碱性基团又含弱碱性基团)三种阴离子交换剂。它们与溶液中的离子进行交换时，反应式为：③螯合离子交换剂：这类离子交换树脂具有吸附(或络合)一些金属离子而排斥另一些离子的能力，可通过改变溶液的酸度提高其选择性。由于它的高选择性，只需用很短的树脂柱就可以把欲测的金属离子浓缩并洗脱下来。疏水性离子交换剂含有大量的活性基团，交换容量大、流速快、机械强度大，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷酸及氨基酸等小分子物质，也可用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如SDS)、去污剂(如TritonX—100)、尿素、两性电解质等。(2)亲水性离子交换剂与水亲和性较大，有纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖等。①纤维素离子交换剂又称离子交换纤维素，是以微晶纤维素为基质，引入电荷基团构成的。分为强酸性、弱酸性、强碱性及弱碱性离子交换剂。纤维素离子交换剂中，最广泛使用的是二乙胺基乙基(DEAE一)纤维素和羧甲基(CM一)纤维素。近年来Pharmacia公司用微晶纤维素经交联作用，制成了类似凝胶的珠状弱碱性离子交换剂(DEAE—Sephacel)，结构与DEAE一纤维素相同，对蛋白质、核酸、激素及其他生物聚合物都有同等的分辨率。微晶纤维-又称纤维素胶或结晶纤维素性状：白色或几乎白色的细小粉末，无臭，无味，可压成自身粘合的小片，并可在水中迅速分散，不溶于水、稀酸、稀碱溶液和大多数有机溶剂。制法：将纤维性植物材料与无机酸捣成浆状，经处理使之降解后漂洗、研磨、脱水、烘干、粉碎制成。目前常用的纤维素交换剂交换剂（简写）类型功能基团交换容量（毫克当量/g）适宜pH磷酸纤维素（P-C）中强酸型阳离子交换剂—PO32-0.7~7.4Ph4磺酸乙基纤维素（SE-C）强酸型阳离子交换剂—(CH2)2SO3-0.2~0.3极低羟甲基纤维素（CM-C）弱酸型阳离子交换剂—CH2COO-0.5~1.0pH4三乙基氨基乙基纤维素（TEAE-C）强碱型阴离子交换剂—(CH2)2N+(C2H5)30.5~1.0pH8.6二乙氨基乙基纤维素（DEAE-C）弱碱型阴离子交换剂—(CH2)2N+H(C2H5)20.1~1.0pH8.6氨基乙基纤维素（AE-C）中等碱型阴离子交换剂—(CH2)2N+H20.3~1.0Ecteda纤维素（ECTE-C）中等碱型阴离子交换剂—(CH2)2N+(C2H4OH)30.3~0.5离子交换纤维素适用于分离大分子多价电解质。特点：结构疏松，对生物高分子物质(如蛋白质和核酸分子)有较大的穿透性；表面积大，因而有较大的吸附容量；基质是亲水性的，避免了疏水性反应对蛋白质分离的干扰；电荷密度较低，与蛋白质分子结合不牢固，在温和洗脱条件下即可达到分离的目的，不会引起蛋白质的变性。但纤维素分子中只有一小部分羟基被取代，结合在其分子上的解离基团数量不多，故交换容量小，仅为交换树脂的1/10左右。②交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂是以交联葡聚糖G–25和G–50为基质，通过化学方法引入电荷基团而制成的。交换剂G–50型适用于相对分子质量为3×104～3×106的物质的分离，交换剂G–25型能交换相对分子质量较小(1×103～5×103)的蛋白质。交联葡聚糖离子交换剂的性质与葡聚糖凝胶相似，在强酸和强碱中不稳定，在pH＝7时可耐120℃的高热。它既有离子交换作用，又有分子筛性质，可根据分子大小对生物高分子物质进行分级分离，但不适用于分级分离相对分子质量大于2×105的蛋白质。③琼脂糖离子交换剂主要以交联琼脂糖CL–6B为基质，引入电荷基团而构成。这种离子交换凝胶对pH及温度的变化均较稳定，可在pH3～10和0～70℃范围内使用，改变离子强度或pH时，床体积变化不大。如DEAE–SepharoseCL–6B为阴离子交换剂；CM–SepharoseCL–6B为阳离子交换剂,它们的外形呈珠状，网孔大，特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离，即使加快流速，也不影响分辨率。按骨架结构不同，离子交换树脂可分为：凝胶型和大孔型。苯乙烯或丙烯酸与交联剂二乙烯苯聚合而成，透明，没有毛细孔，吸水后形成微细的孔隙，适合交换无离子等小分子。苯乙烯或丙烯酸与交联剂二乙烯苯的异构体聚合，经过特殊的物理处理，行成大网孔，再导入交换基团制成，不透明，既有微孔又有大粗孔，吸附大分子，耐污染。疏水性离子交换剂（树脂）的命名（D）①②③×④（D）——大孔型无——凝胶型①分类代号0—强酸1—弱酸3—弱碱4—螯合5—两性6—氧化还原活性基团②骨架名称0—苯乙烯系1—丙烯酸系2—酚醛系3—环氧系4—乙烯吡啶系5—脲醛系6—氯乙烯系③顺序代号用以区别交换基团或交联剂的差异。④交联度（%）例：001×7凝胶型苯乙烯系强酸阳离子交换树脂交联度为7%D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂亲水性离子交换剂的命名交换基团写在前面，然后写骨架，最后写原骨架的编号。在编号前加C、A以区分阳离子和阴离子。如：DEAE-SephadexA-25CM-SephadexC-25二、性质1、颜色与形状树脂类离子交换剂：褐色、黄色、乳白色等亲水性离子交换剂：白色珠状2、交联度交联度：交联剂在离子交换剂中的比例，用重量百分率表示。3、膨胀度（吸水量）膨胀度：每g干胶在水或其他规定的溶剂中，在一定时间与温度条件下膨胀后所占有的体积毫升数。影响膨胀度的因素有：（1）、基质（2）、电荷基团（3）、离子强度和pH值亲水性离子交换剂大，疏水性离子交换剂小。与交联度的关系。强碱和强酸大于弱碱和弱酸；电荷数和性质相同，相差不大。交联度大的离子交换剂对离子强度和pH值不敏感。交联度小或者弱的离子交换剂相反。4.交换容量交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数（meq/mg或meq/ml）表示。总交换容量：理论交换容量，