传染性胃肠炎和猪呼吸道冠状病毒

传染性胃肠炎和猪呼吸道冠状病毒传染性胃肠炎(TGE)指的是一种高度接触传染性肠道疾病，以引起两周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率(通常100%)为特征。虽然不同年龄的猪对这种病毒均易感，但5周龄以上猪的死亡率则很低。Doyle和Hutchings(1946)于1945年首次报道在美国发生了本病。尽管TGE在此之前就已存在，但美国对其也是逐渐认识的。据报道，TGE于1956年发生在日本(Sasahara等，1958)、1957年发生在英国(Goodwin和Jennings，1958)。从那时起，世界上大多猪群在产仔期间发生TGE，其损失最大而诊断亦最容易。相反，如该病发生于育成猪、育肥猪或成年猪时，由于临床症状轻微，一般只有数天厌食或腹泻，常常得不到确诊。由于存在这些未被诊断的感染猪，所以，血清学调查则较能准确的显示TGEV流行情况。各类调查表明，在欧洲和北美洲有19%～54%抽检猪群TGEV抗体阳性(Gagnon等，1974；Toma等，1978；Egan等，1982)。在美国阳性率亦达36%(USDAAPHISVS1992)。最近，在欧洲许多国家，几乎100%猪群TGEV抗体阳性，这种状况的产生是由于在1984年被发现，并迅速蔓延全欧洲的TGE病毒的变异株--猪呼吸道冠状病毒(PRCV)所致(Brown和Cartwright，1986;Pensaert等，1986;Pensaert，1989,Pensaert和Cox，1989;Laude等，1993;Pensaert等，1993)。正如早期研究表明，TGE造成巨大经济损失(Pritchard，1982,1987;Mousing等，1988)。但在北美，它对经济的影响仍然严重，在欧洲，由于呼吸道病毒(PRCV)的流行，TGE呈下降的趋势(Pansaert和Cox，1989;Laude等，1993)在猪群密集的北美地区，TGE仍被认为是仔猪发病和死亡的主要原因之一。养猪者对此病极为忧虑，因为①新生仔猪死亡率高；②没有有效而实用的治疗方法；③尤其在冬天和初春，为防止该病毒入侵猪群，要求采取严格的生物安全措施；④可买到的商品疫苗产力不高(Bohl等，1975；Moxley和Olson，1989a;Saif和Theil，1990)Doyle和Hutchings(1946)描述了TGE感染性因子的可滤过性，这是有关该病毒病原学的最早报道，TGEV属于冠状病毒科，冠状病毒属(Cavanagh等，1995)TGEV有囊膜，形态多样，电镜感染观察全病毒直径为60～160nm(图241)(Okaniwa等，1968;Phillip等，1971；Saif等，1977；Granzow等，1981)。它有一层棒状表面纤突，长12～25nm冠状病毒的形态发生已有论述(Siddell等，1983)。TGEV抗原在感染后早至4～5h用免疫荧光(IF)于细胞浆中可以检测到(Pensaert等，1970a)。病毒的成熟发生于细胞浆中，通过内质网出芽，常在细胞浆的空泡中观察到病毒粒子(直径65～90nm)(Thake1968;Pensaert等，1970b;Wagner等，1973)，病毒从感染细胞排出后常见其排列于宿主细胞膜上，TGEV糖蛋白已在被感染的猪睾丸细胞表面所证实(Laviada等，1990)。生物学特性病毒冷冻贮存非常稳定，但在室温或室温以上不很稳定。据报道，来自患猪肠组织中的病毒于-20℃存放6～18个月未见滴度下降(Young等，1955，Haelterman和Hutchings，1956)。相反，来自患猪肠组织中病毒，在21℃时干燥、腐败状况下，则很不稳定，3天后接种猪4头，只有两头发病；10天后接种，未检测到病毒(Bay等，1952)置于37℃，每24h病毒滴度下降一个log10(Young等，1955)。细胞培养病毒分别存放于-20℃、-40℃、-80℃，365天后滴度无明显下降，而存放于37℃4天，感染性全部消失(Harada等，1968)。病毒若以液浆状态保存，其感染性可保持：5℃8周以上；20℃2周；35℃则仅24h(Haas等，1995)病毒对光很敏感。Haelterman(1963)报道，将含有105感染剂量(PID)猪粪便样品放在阳光下6h内病毒被灭活。Cartwright等(1965)还报道了将一细胞病变毒株放于实验台上、暴露于紫外灯下的光敏作用。化学稳定性方面TGEV可被003%福尔马林、1%Lysovat(苯酚和醛)、001%丙内酯、次氯酸钠、氢氧化钠、碘、季胺盐化合物、醚和氯仿灭活(Harada等，1968；Nakao等，1978；Brown1981;VanCott等，1993)。如报道的其它肠道病毒那样，TGEV野毒株可抵抗胰酶，在猪胆汁中比较稳定，在pH3条件下稳定(Harada等，1968；Moscari1980a;Laude等，1981)。由于这些特性，病毒在胃和小肠中能够存活。弱毒株和野毒株在这些特性上不同，但大部分研究报告都未能阐明TGEV对这些不同处理的敏感性和在细胞培养代次，或病毒毒力强弱之间的相关性(Furunchi等，1975；Hess和Bachmann，1976;Moscari，1980a;Laude等，1981)。TGEV和缺失变异株PRCV都是囊膜病毒，它们含有一个大的、多腺甘酸、单链、正股基因组RNA(genomicRNAofpositivesensepolarity)。基因结构，复制过程以及病毒蛋白的表达都与其它冠状病毒类似(Laude等，1990，1993;Enjuanes和VanderZeijst，1995)，TGEV的基因组RNA具有传染性，Purdue115病毒株是由28579个核甘酸组成(Kapke和Brian，1986;Rasschaert和Laude，1987;Rasschaert等，1987；Eleouet等，1995)TGEV的蔗糖浮密度为118～120g/ml(Brian等，1980;Jimenez等，1986)，病毒囊膜中的磷脂和糖脂是由宿主细胞诱导产生的，所以，囊膜的构成依赖于宿主细胞(Pike和Garwes，1977)完整的TGE病毒包含四种结构蛋白：一个大的表面糖蛋白(Spike或S)；一个小的蛋白(SM)，一个完整的膜糖蛋白(M)，以及一个核壳蛋白(N)(Garwes和Pocock，1975;Spaan等，1988；Godet等，1992)。蛋白N(47kD)与TGEV的RNA结合形成一个螺旋状核糖蛋白复合物，这种结构与蛋白M形成一个球状亚病毒的内部核心(Risco等，1996)。这个29～36kD糖蛋白M，通过3～4跨越膜的部分牢固地镶嵌于病毒的包膜内，并以两种不同的形式出现(Risco等，1995)；一是，蛋白M的N末端是病毒包膜外部，而C末端在膜的内部；二是分子的两个端都在病毒粒子的外部。上述两种形式中，亲水性的N末端与可接受一个糖基的位点决定干扰素的产生(Charley和Laude，1988)。M蛋白突出的N末端和C末端上的抗原位点能结合补体依赖的中和单克隆抗体(MABs)(Woods等，1988;Laude等，1992；Risco等，1995)。S糖蛋白作为一个完整的复合体在电镜下观察像&34;皇冠&34;状(图241)。S糖蛋白(170～220kD)的机能作用，包括病毒中和(依赖补体)，病毒吸附于细胞，膜的融合以及血细胞凝集等。Garwes等(1978/1979)已经证明，钝化后的S糖蛋白，能诱导产生TGEV的中和抗体，该抗体能中和繁殖过程中不同阶段的病毒(Nguyen等，1986；Sune等1990)N和在ST细胞及猪小肠绒毛上皮细胞的一种200kD表面蛋白，已被证明是病毒受体(Delmas等，1992；Weingartl和Derbyshire，1994)。氨肽酶受体结合部和S蛋白上主要中和位置(SiteA)都在同一范围内(Godet等，1994)。用唾液酶处理TGEV可增强其细胞凝集活力(Noda等，1987；Schultze等，1996)，这种凝集活性位于TGEVS蛋白N末端部位，而PRCVS蛋白正缺少这一部位，因此，根据有无细胞凝集现象出现，可区别PRCV和TGEV毒株(Schultze等，1996)。已用TGEV弱毒株(Jimenez等，1986;Laude等，1986；Correa等，1990；Delmas等，1990)和强毒株(Welch和Saif，1988;Zhu等，1990；Simkins等，1992，1993)生产单克隆抗体，并用其鉴定TGEV蛋白种类和找出诱导抗体的抗原位点。在S蛋白上的中和因子，大量存在于PRCV和TGEV毒株(Jimenez等，1986；Laude等，1986；Garwes等，1987；Welch和Saif，1988；Sanchez等，1990；Simkins等，1992，1993)。用中和单克隆抗体在S蛋白标定抗原位点显示有四种不同抗原位点(A、B、C、D)，其中，通过强力中和单克隆抗体确认A、B为主要的免疫抗原决定簇(Garwes等，1987；Simkins等，1992，1993；Correa等，1990；Delmas等，1990；Gebauer等，1991)，而其它位点(D、C)也能诱导中和抗体(Laude等，1986，Posthumus等，1990)，四个主要抗原位点的每一个位置被标在S糖蛋白的主要结构上。从氨基末端开始，MadridGroug将这些位点定为C、B、D和A(Correa等，1990)，而ParisGroup则定为D、C和A、B(Delmas等,1990)。Paris的D、C和A、B位点(除特殊说明外，本章使用该名称)与Madrid位点B、D和A分别相互重迭。用抗TGEV单克隆抗体的变异株，确认了A位点上的三个亚位点Aa、Ab、Ac(Correa等，1990)已知猪传染性胃肠炎病毒只有一种血清型(Kemeny，1976)。病毒中和(VN)试验不能区分猪呼吸道冠状病毒(PRCV)与从肠道分离出的TGEV毒株(Pensaert，1989;Pensaert和Cox，1989)，但可用阻断ELISA试验(参照以下诊断部分)或通过PRCV的S基因大量缺失，导致其S蛋白(170～190kD)小于TGEV的S蛋白(220kD)(Enjuanes和VanderZeijst，1995;Siddell，1995)，它们是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、狗冠状病毒(CCV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猫肠道冠状病毒(FECV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和人类冠状病毒(HCV229E)。根据病毒中和(VN)免疫荧光(IF)交叉反应以及用单克隆抗体与蛋白S，N或M进行鉴定，在这7种病毒中，只有TGEV，PRCV，CCV，FIPV和FECV具有抗原相关性(Pedersan等，1978;Reynolds等，1980;Woods,1982;Enjuanes和VanderZeijst,1995)。所有这些相关性抗原位点共同存在于S蛋白上亚抗原位点AC上(Enjuanes和VanderZeijst,1995)。另外，用放射免疫沉淀、免疫印迹和ELISA方法证明了TGEV、CCV和FIPV病毒蛋白S、M和N之间有交叉反应，说明这几种病毒其实是同一始祖病毒的变异株(Horzinek等，1982)用多因子血清做免疫印迹试验，也观察到在TGEV和PRCV的结构蛋白S、M及N之间有类似交叉反应(Callebaut等，1988)猪流行性腹泻病毒(PEDV)是另一种与TGEV相似的猪冠状病毒，此病仅在欧洲和亚洲有记载，对美国成年猪的一次血清抽样调查中，尚未测出PEDV抗(DeBouck等，1982;LJSaif和MBPensaert1990)。有报道称，有人用PEDV，FIPV，CCV，TGEV和被称为水貂冠状病毒的N蛋白做免疫印迹交叉反应(Yaling等，1988；Have等，1992)，用多因子血清和单克隆抗体等其它血清