第七章 抗体酶

第七章抗体酶一、抗体酶概述抗体是和抗原结合的物质。抗体与靶分子精确匹配。产生高度特异性和亲和性。免疫系统可以产生108～1010个不同的抗体分子（多样性）抗体结构抗体分子是由两条轻链(L链)和两条重链(H链)通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。能否利用抗体的这些特性将抗体开发成象酶那样的催化剂呢？1969年，Jentcks根据Panling的化学反应过渡态理论预言，用过渡态类似物，作为半抗原，产生的抗体，该抗体具有酶催化反应的基本特征。1986年《Science》同时发表了两篇来自由Lemer和Schultz分别领导的两个研究组的发现具有酶催化能力的抗体研究报告，揭开研究抗体酶的热潮。取得的成果：天然酶所催化的6种酶促反应数十种类型的常规反应的抗体酶。包括酯、羧酸和酰胺键的水解，酰胺形成，光诱导裂解和聚合，酯交换，等等。抗体酶（abzyme）：是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，也叫催化抗体。特点：1、反应专一性相当于或超过自然酶反应的专一性，2、催化速度有的可达到自然酶催化的水平。但一般来说比非催化反应快102～106倍，比天然酶催化反应速度慢，仅为它的10-4-10-2。革命尚未成功，同志仍需努力。二、抗体酶的制备方法1.诱导法以Pauling的稳定过渡态理论为指导，即酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。例1：Schultz研究小组以羧酸二酯水解反应的过渡态类似物对硝基苯磷酰胆碱作为半抗原，诱导产生单克隆抗体，经过筛选找到一株MOPC167。使水解反应速度加快12000倍。例2：Napper等用一个环化的磷酸酯作为过渡态类似物，得到单克隆抗体24B111、可催化外消旋的羟基羧酸酯分子内环化形成内酯；2、加速反应167倍；3、产物中一种对映体的含量比另一种高出94％。这类抗体可用于含有酸或醇功能基的合成中间物的手性拆分，有重要的商业价值。2.抗体与半抗原互补法抗体与其配体的相互作用是相当精确的。抗体常含有与配体功能互补的特殊功能基。在开发诱导抗体酶的产生时，一个重要的目标是产生的抗体结合部位的催化基团和半抗原的结合直接相关。例：Shokat等利用抗体与半抗原之间的电荷互补性制备了针对带正电半抗原的抗体3.多底物类似物法很多酶的催化作用要有辅因子参与，辅因子包括金属离子、血红素、硫胺素等。因此，将辅因子引入抗体结合部位将会扩大抗体催化作用的范围。用多底物类似物对动物进行一次免疫，可产生既有辅因子结合部位，又有底物结合部位的抗体。4.抗体结合部位修饰法在抗体的抗原结合部位引入催化基团。方法有两种：（1）选择性化学修饰法（2）基因工程定点突变法亲和标记（修饰法的重要一种技术）1、可裂解亲和试剂与抗体作用；2、用二硫苏糖醇（DTT）处理，则在抗体结合部位附近引入巯基；3、用此巯基作为锚引入其他化学功能基（如咪唑）。例：使用可裂解亲和标记物将含巯基的柄状亲核基团引入到抗2，4-二硝基苯酚（DNP）的单抗的抗原结合位点，得到的抗体酶对含有(DNP)与香豆素的羧酸酯的水解反应的催化效率比二硫苏糖醇高104倍。基因工程定点突变法通过基因工程，精确地将催化基团引入到抗体的结合部位上。例：Schultz小组用此法将催化基团组氨酸插入到对二硝基苯专一的抗体（MOPC315）的结合部位。合成了VL片断的基因，其中抗体结合部位的Tyr34被组氨酸取代,然后用大肠杆菌表达重组的VL,再将VL链与天然的VH链组合在一起，则得到具有显著酯解活力的抗体酶。5.抗体库法即用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来,重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片断，从中筛选特异性的可变区基因。三、抗体酶的应用在抗体酶被发现的13年以后，他们才开始进入商业领域。目前已有一些公司，比如：美国的Med-Immune和Prolifaron公司以及以色列的AdvancedBiotechLtd.致力于抗体酶的商业应用，并且取得了一些业绩。1.抗体酶在有机合成中的应用抗体的多样性，专一性标志着抗体酶的应用潜力巨大。精细化工产品和合成材料需要精确底物专一性和立体专一性的催化剂，而这正是催化抗体的突出特点。天然酶不能催化的反应，可通过设计定做抗体酶来弥补天然酶的不足。2.用于阐明化学反应机制3.抗体在医疗上的应用抗体酶既具有抗体功能，又能执行一定的催化功能。例如，用抗体酶活化处于靶部位的药物前体，以降低药物毒性，增加其在体内的稳定性。例如：戒毒用可卡因水解的过渡态类似物---磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。四、抗体酶研究进展主要进展表现在如下3个方面：（1）半抗原设计方法有创新；（2）抗体催化的化学转化范围有所扩大；（3）又有一些催化抗体的结构得到表征。1.反应性免疫利用反应性半抗原迸行的，这种半抗原可在生理pH下释放出传统的过渡态类似物，或者在免疫应答的B细胞水平上捕获亲核体。2.抗体酶的化学筛选使用基于机理的筛选试剂可从抗体组合库中通过化学选择筛选出抗体。3.抗体酶催化的化学转化催化抗体是不对称合成的理想催化剂，抗体催化的反应已达80余种，而且还在不断增加。