高效液相 色谱 基本原理资料

主讲：张中一青岛大学-化学科学与工程学院(环境科学与工程学院)Tel:[phone]Email:[e-mail].2高效液相、气相色谱高效液相色谱：在液相色谱柱中，采用颗粒极细的高效固定相，采用高压输液泵输送流动相，全部工作过程通过仪器控制完成。高效液相色谱法优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。尤其适用于那些不宜用气相色谱分析的难挥发性物质、热不稳定性物质、离子型物质和生物大分子等。目前已知化合物中，80%的有机化合物可用高效液相色谱分析。检测信号和时间的关系图不同的色谱峰对应相应的组分可以得到相应组分的保留时间和峰面积信息。保留时间–定性分析峰面积–定量分析保留值：保留时间(tR):试样组分从进样到出现最高峰时多需要的时间。死时间（to）:不被保留物质从进样到出峰最大值的时间。调整保留时间(tR′)：tR′=tR-to容量因子κ′：等于（固定相中溶质的量/移动相中溶质的量）相对保留值α：表示相邻两峰调整保留时间的比值。理论塔板数N：对于色谱峰柱效率的一种度量。分离度Rs：色谱柱总分离效率的指标，代表了两组峰的分离效果。峰高（PeakHeigh)：从峰最大值到峰底的距离峰面积（PeakArea)：峰与峰底之间的面积峰面积=半峰宽*出峰高度(A=h*W)Wh两个相邻峰的分离程度。以两个组份保留值之差与其平均半峰宽值的比来表示：•当R1时，两峰会有部分重叠•当R=1时，两峰少有重叠（5％的重叠）•当R1.5时，两峰完全分离（分离程度为大于99.7%）1212)(2WWttRRRs分离度（Resolution)提高分离度的途径1）增加N：增加柱长，提高填充剂效能。N增加峰型变窄。2）增加α：改变固定相、流动相极性或用梯度洗脱，延长分离时间。3）改变κ′：移动相极性减小则κ′增加，流出时间增加，峰型变宽分离度提高。高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。高压输液泵要求能提供连续无脉冲的液流。泵所供应的恒定流量变动不宜超过1%，流量范围在0.1-10mL/min，泵压一般在10-40MPa。商品泵主要包括：螺旋注射泵、气动放大泵、往复柱塞泵等。高效液相色谱柱是决定分离效率的核心部分。一般采用不锈钢材料制成。色谱柱内壁应经过精密加工，具有高的光滑度。两端接头采用不锈钢或聚四氟乙烯密封圈。常用色谱柱的内径在2-6mm，长度在10-50cm。色谱柱中紧密填充粒度为5-10微米的颗粒状固定相。最常用柱子是C-18柱（ODS柱）高效液相色谱可分为分析型和制备型两种。分析型色谱柱常用内径为1~6mm的管子，而制备柱则用较粗的管子，一般用内径为25mm的管子，有的可达60mm。柱子长度从几十厘米到几米，一般为25cm到1m。高效液相色谱常用的商品检测器有紫外检测器、荧光检测器、示差折光检测器、光散射检测器和电化学检测器等。检测器性能紫外-可见检测器示差折光检测器荧光检测器电化学检测器应用范围测量参数线性范围检测限/g.ml-1能否用于梯度洗脱对流速的敏感性对温度的敏感性选择性吸光度2.410410-9能不敏感低通用性折射率10410-10不能不敏感敏感选择性荧光强度10310-10能不敏感低选择性电流10410-10不能敏感敏感紫外-可见检测器：是高效液相色谱中最广泛应用的检测器，适用于那些能在紫外/可见区有吸收的物质。传统的紫外-可见检测器一般选择在最大吸收波长处进行检测。近年来发展起来的二极管阵列检测器可以实时记录各个波长下的吸光度，可以给出每个色谱峰的保留时间-吸光度-吸收波长的三维谱图。荧光检测器：适用于检测紫外光激发后能产生荧光的物质。其灵敏度比紫外-可见检测器高2-3个数量级，可检测出ng级痕量有机物。具有极高的灵敏度和良好的选择性。示差折光检测器：对一些紫外没有吸收的样品可以用示差折光检测器，它是通过检测溶液折光指数的变化来测定样品浓度的。它是一种通用检测器。但是其灵敏度比紫外-可见检测器低3个数量级，受温度影响波动大，不适用于梯度淋洗。1）正相色谱与反相色谱2）分离方式的选择分子量大于2000以上的大分子和高分子可采用凝胶色谱；极性大的水溶性化合物，在水中可以解离的离子化合物可采用不同类型的离子交换树脂作为填料；在水中溶解但不电离的化合物，如糖类、可以用反相色谱，以甲醇或乙腈-水为流动相；醇水不溶的弱极性和非极性样品主要用正相吸附色谱法，以全多孔硅胶或氰基键合硅胶为固定相。气相色谱法(gaschromatography，GC)是采用气体作为流动相的一种色谱法，具有高灵敏度、高选择性、高效、快速分离的特点。在气相色谱中，流动相(称为载气)不和组分分子相互作用，其功能仅仅是携带试样。气固色谱-固定相是具有多孔性及大表面积的吸附剂微粒。气液色谱-固定相是载体表面涂一层高沸点有机化合物的液膜(称为固定液)。气相色譜高效液相色谱只能分析约20%挥发性物质几乎可分析各种物质不能分析热不稳定物质可分析热不稳定物质使用毛细管柱可得到很高的柱效色谱柱不能很长，柱效相对较低有很灵敏的检测器(ECD)和较灵敏的通用型检测器(FID&TCD)无灵敏的通用型检测器流动相为气体无毒，较易处理流动相毒性、费用较高运行操作容易运行操作比气相难进样时分离时洗脱时基础化學塑胶农药杀虫剂添加剂石化工业原油分析模拟蒸馏油品分析天然气分析汽油添加剂分析环境检测空气污染水污染固体废弃物土壤分析食品分析食物飲料香精香料农残制药/刑偵新药开发品質管制有机溶剂残留药物滥用控制面板气路控制压力控制柱箱计算机色谱工作站检测器进样口气体钢瓶1-载气钢瓶；2-减压阀；3-净化器；4-气流调节阀；5-转子流量计；6-气化室；7-色谱柱；8-检测器①气路系统气路系统是一个密闭的管路系统，载气在其中稳定连续地运行，要控制好载气的纯度和载气流速。它包括载气源、净化干燥器、减压阀、稳压阀、稳流阀、压力表、流量计、各种管线等。常见的气相色谱仪有单柱单气路和双柱双气路两种类型，当前一般气相色谱仪都是双柱双气路的，这种气路结构的仪器既能用于恒温分析，也适用于程序升温分析。②进样系统由进样器和气化室组成。气化室的作用是将液体样品瞬间气化，但又不发生分解。要把气体或液体样品快速而定量地加到色谱柱上端。③分离系统(色谱柱)色谱柱是气相色谱的心脏，样品的分离就是在柱内进行的。色谱柱由柱管和其中的固定相组成。填充柱的内径约为2～6mm，长约1—6m，用不锈钢、铜、玻璃或聚四氟乙烯等材料制成，管内装填颗粒状的固定相。色谱柱的外形有螺旋形和u型两种，色谱柱被安装在密闭隔热的柱箱内，以利于准确控制柱温。柱内固定相是分离的关键。④检测系统检测系统由检测器及其控制装置组成，其作用是将被色谱柱分开的各个组分的浓度或质量信号转变成易于测量的电信号，并输送给放大记录系统。检测器的温度对灵敏度等有一定影响，故也应进行严格控制。检测器是色谱仪中的一个关键部件。常用的检测器有热导池检测器、氢火焰离子化检测器、电子捕获检测器和火焰光度检测器等类型。⑤记录系统该系统包括放大器、记录仪或数据处理装置等。由于检测器产生的电信号十分微弱，所以必须用放大器放大，再由记录仪记录下代表各组分的色谱图，供定性定量分析用。采用气相色谱与微机联机的仪器，操作人员可直接使用按色谱术语设计的键盘，来完成各种功能的色谱操作和数据的处理，并将结果直接打印出来，快速准确。⑥温度控制系统温度是气相色谱分析中的最重要最敏感的工作条件之一，要求对气化室、检测器和色谱柱分别进行严格的温度控制，控温精度均为±0.1℃。仪器上有3套独立的自动温度控制电路及其辅助设备，分别使气化室、检测器恒定在适当温度，使柱温恒定或按程序升温。温度控制系统的主要元件有铂电阻或热电偶等热敏元件，电子放大器、可控硅、电热器等，柱箱中还有排风扇。通常用温度计和测温毫伏计来显示温度的高低。作用：◦1）载气：作为色谱的流动相◦2）检测器的工作气体。载气：惰性：He,Ar,N2,H2.根据检测器,价格及方便程度来决定采用压力调节器以获得恒定的仪器输入压力控制流量来得到恒定的流速•气体的类型由检测器决定.•气体要求色谱级的高纯气体99.999%•过滤系统:•除氧.•活性炭除碳氢化合物。•分子筛除水DetectorTCDECDFIDPFPDTSDCarrierGasesHeN2H2ArN2CH4+ArrHeN2H2N2HeH2HeN2FuelGasesH2AirH2AirH2Air载气推荐采用H2、He:1)分离度好2)对TCD灵敏度最高，而且可保护W丝3)注意安全问题作用：样品进样和汽化.要求：精度和重现性根据样品的性质选择进样技术图4-11旋转式六通阀(a)取样位置；(b)进样位置填充柱毛细管柱•长：2-3m•长：10-100m•内径：2-4mm•内径：0.1-0.8mm•玻璃和金属材质•熔融氧化硅或不锈钢，聚酰亚胺涂层•填充柱-短(2-3米),管内径较粗.•毛细管柱-长(60米),内径较细.所有材料均要求化学及热性质稳定.–热稳定性-分析时所使用的温度不应致使色谱柱材质受到破坏–化学稳定性-在一定温度下，色谱柱材质不受分析物的影响注意：用色谱级、干净的材料。玻璃、特氟珑及不锈钢材质(惰性).材质内径外经长度不锈钢2mm1/8inch2-3meters玻璃2mm1/4inch2meters特氟珑2mm1/8inch10metersPack•填充柱中填有固态载体，上面涂有液态固定相，用于气液色谱（GLC）或直接填充多孔固体，用于气固色谱（GSC）.填充柱尺寸是液态固定相附着的载体增加与样品接触的表面积。细小、均匀、多孔。大部分采用硅土.标准大小颗粒.颗粒大小（目）平均的直径范围60/80177to260m80/100149to177m100/120125to149m120/140105to125m直径大小与目数的关系例如:80/100目表明所有的颗粒将通过80目筛但不通过100目筛.80目筛是指筛网每英寸有80根标准直径的网线。通用型检测器（UniversalDetector)热导检测器（TCD）氢火焰检测器（FID）选择性检测器电子捕获（ECD）脉冲火焰光度检测器（PFPD）氮磷检测器（TSD)检测器选择性检测限线性动态范围通用型检测器TCD有机物、无机物非破坏性0.2ppm104FID有机物破坏性10pg/sec107选择性检测器ECD卤素、过氧化物、醌类、硝基化合物0.01ppb103TSDP、NP：0.05pg/secN：0.1pg/sec103105PFPDP、S、N&25个其它元素P：0.1pg/secS：1pg/secN：20pg/sec104103to103色谱相当重要的应用◦决定组分质量、浓度或物质在样品中占的百分比◦平均或标准偏差用來作分析精密度的表示定量结果的数种计算方式◦出峰高度分析(peakhigh)◦出峰面积分析(peakarea)◦外标法(externalstandard)◦內标法(internalstandard)◦百分归一法(normalizedpercent)范例PeakNO.TR(min)AreaCountsArea%11.84220,0006.622.75103,0003.133.301,212,00036.143.80494,00014.754.79701,00020.965.10329,0009.875.59297,0008.8TotalAreaCounts:3,356,000100校正因子校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分的量。可用下式表示：Mi–I组分的量；fi–I组分的校正因子；Ai–I组分的峰面积定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但相同含量的物质由于物理、化学性质的差别，即使在同一检测器上产生的信号也不同，直接用响应信号定量，必然导致较大误差。故引入校正因子。iiiAfm将样品中所有组份的含量之和定为1