DNA重组克隆的单元操作

第2章DNA重组克隆的单元操作DNA重组的载体；DNA的体外重组；重组DNA分子的转化与扩增；转化子的筛选与重组子的鉴定；目的基因的克隆。2.1用于基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征1.载体的功能①为外源基因提供进入受体细胞的转移能力②为外源基因提供复制能力或整合能力③为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2.载体应具备的条件①具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。③具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。④具有合适的筛选标记。②具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。质粒1.质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中。绝大多数的质粒是DNA型的。绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构。质粒DNA的分子量范围：1-100kb。质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合oriE.coliColE1plasmid复制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep可扩增性根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1-5拷贝stringentplasmid松弛型复制控制的质粒30-50拷贝Relaxedplasmid质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：①接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。②非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F拥有相似的复制子结构，彼此不相容携带特殊的遗传标记物质抗性：抗生素、重金属离子、紫外线、X射线物质合成：细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。2.质粒的改造与构建野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多由pSC101、ColE1和pSF2124构建。①删除非必需区域DNA。②灭活某些质粒的编码基因。如mob基因，负调控基因③加入标记基因。④添加MCS，删除重复酶切位点。⑤加上一些调控序列。3.质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒扩增基因低拷贝质粒表达某些毒性基因测序质粒用于测序整合质粒外源基因的整合穿梭质粒基因克隆表达质粒表达外源基因探针质粒启动子等元件的克隆筛选4.重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制pBR322：氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆pUC18/19：拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’BamHIpUC182686bpAprlacZ'oriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIIIpUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段abOHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal蓝色pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3ZPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶。如E.coliBL21（DE3）等。①碱溶法i.用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体ii.加溶菌酶裂解细菌细胞壁iii.加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物iv.加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质v.离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质vi.乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNAvii.用无DNase的RNase去除残余的RNAcccDNAL-DNAocDNA5.质粒DNA的分离纯化②沸水浴法i.用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体ii.加溶菌酶裂解细菌细胞壁iii.沸水浴40秒钟iv.离心，用无菌牙签挑去沉淀物v.乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA噬菌体噬菌体是一类特异性的病毒，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。1.大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体的生物学特性l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成l-DNA全长48.5kb全基因组共36个基因①生物结构5’GGGCGGCGACCT3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNA②感染裂解周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75-105%即36-51kbDA③溶原状态l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。l-DNA载体的构建野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：插入型载体取代型载体①缩短长度插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度10kb（51–26）载体长度26kb插入片段最大装载长度25kb（36–26）②删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个。同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。③灭活某些与裂解周期有关的基因，构建琥珀密码子的突变体琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。④加装选择标记野生型l-DNA上缺少合适的选择标记。l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记加装选择标记：cl+含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。加装选择标记：lacZ’lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ’基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑。以EcoRⅠ为例A、B、C、D、E和F片段长度分别为21.6kb、4.9kb、5.5kb、7.5kb、5.9kb和3.3kb用于建立cDNA文库和克隆外源目的基因2.6kb非必需区引入筛选标记l-DNA重组分子的体外包装l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。l-DNA及其重组分子的分离纯化①将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期；②加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37℃培养1小时；③用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解；④超速离心，沉淀噬菌体；⑤苯酚抽提，释放l-DNA；⑥乙醇或异丙醇沉淀l-DNA。l-DNA作为载体的优点①l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒。②l-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量。③重组l-DNA分子的筛选较为方便。④重组l-DNA分子的提取较为简便。2.大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13噬菌体的生物学特性M13噬菌体的外型呈丝状M13噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成M13DNA全长6407个核苷酸M13DNA上有10个基因2700个外壳蛋白分子M13噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长①生物结构②感染周期E.coli基因II蛋白基因II蛋白+DNA+DNA+DNAM13DNA载体的构建IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZ‘polylinker①通过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口；②引入合适的选择性标记基因；④在MCS接头片段的两侧区域改为统一的DNA测序引物。③加入MCS；考斯质粒与噬菌粒考斯质粒和噬菌粒载体的构建是为了提高噬菌体DNA的装载量。将噬菌体DNA中与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。1.考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的构建考斯质粒是一类人工构建的含有pHC796100bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。1.7kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45kb。考斯质粒载体的特点①能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞。④装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围。②能像质粒那样在受体细胞中自主复制。③重组操作简便，筛选容易。⑤不能体内包装，不裂解受体细胞。pUC118pUC18+M13间隔区IGpUC119pUC19+M13间隔区IG500个拷贝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-IGpUC118/119表示M13辅助噬菌体DNA2.噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒载体的构建噬菌粒是一类人工构建的含有丝状噬菌体间隔区（IG）以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。噬菌粒载体的特点①具有质粒的基本性质，便于外源DNA片段的克隆及重组子的筛选;③M13-DNA的重组分子在复制时常会发生DNA缺失，而噬菌粒重组分子则相对稳定；②在一定程度上提高了外源DNA片段的装载量；④通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA。人造染色体载体将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（BAC）酵母人造染色体（YAC）1.细菌人造染色体(BacterialArtificialChromosomesBAC)细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300kb之间。pBACs主要适用于：克隆大型基因簇（genecluster）结构构建动植物基因文库2.酵母人造染色体(YeastArtificialChromosomesYAC)YAC载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序