微生物菌种

第二章微生物菌种选育《发酵工程》第二章微生物菌种选育《发酵工程》第二章微生物菌种选育发酵工程工业生产水平的三个决定要素生产菌种的性能发酵和提取工艺条件生产设备获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节.第一节菌种来源工业发酵常见微生物种类发酵工业上常见的微生物有细菌、酵母、霉菌和放线菌。《发酵工程》第二章微生物菌种选育细菌醋酸杆菌（Acetobacter），用于生产醋酸和维生素C。假单胞菌(Pseudomonas)，荧光假单胞菌发酵生产2-酮基D-葡萄糖酸。乳酸菌（Lactobacillus），发酵生产乳酸。大肠杆菌（E.coli），生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶、天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸。枯草芽孢杆菌生产淀粉酶、蛋白酶和某些氨基酸、肌苷、5’-肌苷酶等。梭状芽孢杆菌生产丙酮-丁醇。北京棒杆菌生产谷氨酸。《发酵工程》第二章微生物菌种选育酵母菌酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）：发面和酿酒及分子生物学用。假丝酵母属（Candida）：生产SCP。汉逊氏酵母属：产乙酸乙酯。毕赤酵母属（Pichia）：工业污染菌。《发酵工程》第二章微生物菌种选育霉菌曲霉属（Aspergillus）：黑曲霉（A.niger）生产柠檬酸、草酸、葡萄糖酸、糖化酶、酸性蛋白酶、果胶酶、单宁酶等；米曲霉（A.oryzae）用于酿酒和L-乳酸生产。青霉属（Penicillum），生产青霉素，桔青霉（P.citrinum）可产生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。根霉属（Rhizopus）用于米酒和黄酒生产，还用于淀粉糖化菌、有机酸发酵及甾体转化。毛霉（Mucor）产生蛋白酶，生产腐乳、酱油，进行甾体转化。《发酵工程》第二章微生物菌种选育放线菌最大的经济价值在于产生多种抗生素链霉菌（Streptomyces）《发酵工程》第二章微生物菌种选育放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源食用菌和藻类《发酵工程》第二章微生物菌种选育工业微生物来源想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。从自然界采集分离。从一些发酵制品中分离目的菌株。《发酵工程》第二章微生物菌种选育微生物菌种的选择性分离工业化菌种的要求能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；遗传性能要相对稳定；不易感染它种微生物或噬菌体；产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；生产特性要符合工艺要求。《发酵工程》第二章微生物菌种选育菌种分离的一般过程土样的采取→富集→分离→目的菌的筛选如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：《发酵工程》第二章微生物菌种选育调查研究（包括资料查阅）试验方案设计采样第一次增殖培养第一次平板分离第二次增殖培养第二次平板分离增殖条件探索根据实际情况进行定量或半定量测定第一次原种斜面第二次原种斜面初筛（1株1瓶）定量或半定量测定筛选工作程序第三次平板分离第三次原种斜面复筛第四次平板分离不纯第四次原种斜面再复筛种子培养初步工艺条件摸索较优菌株1株3-5瓶保藏及进一步做生产性能试验或作为育种的出发菌株某些必要试验和毒性试验第三次菌种保藏分离与筛选的设计要求在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：1、菌的营养特征一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料2、菌的生长温度3、菌的稳定性4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性6、容易从培养液中回收产物3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便有希望成为效益高的生产菌株《发酵工程》第二章微生物菌种选育较复杂；应根据分离目的灵活掌握土壤（丰富、5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）食品、海水、动物、植物、极端环境根据微生物的营养类型采样森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌根据微生物的生理特性采样筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样《发酵工程》第二章微生物菌种选育采样时要注意的问题富集的三种方案：定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件（加热、膜过滤等），进行培养。目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑，不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法《发酵工程》第二章微生物菌种选育定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。《发酵工程》第二章微生物菌种选育目的菌的分离和筛选从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素从形态的角度菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。《发酵工程》第二章微生物菌种选育透明圈法分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊；能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。《发酵工程》第二章微生物菌种选育土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌《发酵工程》第二章微生物菌种选育分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法初筛在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈。透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。但作为初筛的手段是有意义的如何分离磷细菌？《发酵工程》第二章微生物菌种选育变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；《发酵工程》第二章微生物菌种选育用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。如筛选果胶酶产生菌甘油三丁酸酯为底物罗丹明B为指示剂荧光圈又如分离解脂微生物豆油作底物中性红（红～黄.6.8～8.0.）指示菌落周围呈红色圈《发酵工程》第二章微生物菌种选育《发酵工程》第二章微生物菌种选育生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌《发酵工程》第二章微生物菌种选育抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法工具菌采用抗生素的敏感菌若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈《发酵工程》第二章微生物菌种选育抗生素产生菌的分离抑菌圈法、扩散法、生物自显影法等试验菌的选择是关键（关系到灵敏度、活性、抗菌谱等）采用联合试验菌（枯草杆菌和绿色产色链霉菌或巴氏梭状芽孢杆菌）分离到黄霉素采用专一性强的筛选技术也是检出新抗生素的有效方法主要是利用抗生素作用机制相关的酶、酶抑制剂、激活剂等建立的筛选技术如棒酸（clavulanicacid）的发现：通过鉴定氨苄青霉素和待测样品对-内酰胺酶产生菌克雷氏菌的协同抑制作用《发酵工程》第二章微生物菌种选育抗肿瘤药物产生菌的分离临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质大部分具有抗菌或抗真菌的活性现发展出利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法，如生化诱导分析法《发酵工程》第二章微生物菌种选育酶抑制剂产生菌的分离某些酶与病理相关如果某种化合物能在体外抑制某关键的人体酶，它就可能在体内有药理作用选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶靶区靶酶抗高血压血管紧张素转移酶抗糖尿病-淀粉酶、蔗糖酶等抗血脂症缩合酶抗组氨组氨酸脱羧酶、组氨-N-甲基转移酶《发酵工程》第二章微生物菌种选育生长因子产生菌的分离通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，来检测生长因子产生菌。分离培养基上培养被杀死的菌落周围有无检测菌的生长圈影印到能支持生长因子产生菌生长的培养基上Uv照射杀死菌落铺上一层含相应生长因子缺陷型菌株《发酵工程》第二章微生物菌种选育第二节发酵高产菌种选育菌种选育是应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。微生物育种的方法包括自然育种、诱变育种、细胞工程育种和DNA重组技术育种等。《发酵工程》第二章微生物菌种选育自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。自发突变(spontaneousmutation)，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。《发酵工程》第二章微生物菌种选育自然突变两种情况：生产上所不希望的：菌种的衰退和生产质量下降对生产有益的：生产性能提高制备单孢子（单细胞）悬液适当稀释在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株自然选育的一般程序《发酵工程》第二章微生物菌种选育自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。《发酵工程》第二章微生物菌种选育诱变育种诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺。目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为20U/ml，通过多次诱变育种现已达50000-100000U/ml。虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。《发酵工程》第二章微生物菌种选育原始菌株（出发菌株）活细胞计数诱变剂处理活细胞计数中间培养突变株分离初筛复筛生产性能试验诱变预备处理诱变育种的工作程序《发酵工程》第二章微生物菌种选育1、出发菌株的选择选择时注意以下几点：1）选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株。2）最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。3）采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快，营养要求低等。4）由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。例如，在金霉素生产菌的诱变中，失去（黄色）色素的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。《发酵工程》第二章微生物菌种选育2、单细胞（或单孢子）悬液制备一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理。因为1）分散状态的细胞