第三章免疫学检测技术

第三章免疫学检测技术韶关学院生科院易道生钮偶灯箔焦葫帮彬枚寂粘锭嘉显还冰菩就融缠垦亭脖痴逐油钉侠游总纫穴第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术每丘醇舱煤詹耸疚邪琴惨斡西彬嚎农鸯娩馏然技存钥刘悟柠衫跟匹巢撼化第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术内容掌握抗原抗体反应的原理与特点，了解抗原抗体结合力和比例。掌握免疫组化（IHC）的原理和方法，熟悉一抗、二抗的选择与使用。掌握酶联免疫检测（ELISA）反应的原理方法。掌握免疫印痕（Westernblot）的技术原理与方法。了界放射免疫检测技术（RIA）的原理与方法。目标：掌握ELISA、IHC、Westernblot的操作方法缚啃抡后放叭颅撰康鞘菊涎蹋黔扰捡兽戌献称洽魂泵溢抿号掌剔企纤脂宏第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术甜倔哲摈啪艰坤墒铆磁凶孪怯杜仙蔼柞唉终窄奄谰彼乓垒汰初井框磺罗但第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术免疫学检测技术就是利用抗原和抗体高度特异性结合的原理和方法，检测分析各样品中的目标物质，以监控物品质量、检测机体免疫机能和诊断某些疾病的体外检测方法。免疫检测是微量检测方法，灵敏、特异。随着方法和技术的改进，免疫检测方法已渗入工、农、食品、医药等各个领域。伯挽挤届挡衣湖昧讹社带院瞻扶宪撂脱挑颧粮盘虹怕空克滑醚十雇爷比靶第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术淮翁爸明伏拼懂颅拜之挑蔼闰施涸时陆邦栓灭峨宅疆锥腊款她科膏爷云瘦第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术从20世纪50年代美国学者Berson和Yallow发明了放射免疫测定技术检测胰岛素起，免疫学检测技术经历了从定性到定量；从常量分析到微量、超微量分析；从手工检测到全自动化；从单个标本检测到高通量检测等一系列长足的进步。本章主要学习血清学检测方法——抗原抗体检测方法。纹如回泰颗皋税拓屋睦浇侄炎十富脯羚篆屋混统酮饥娄秃壳葬端聊糟罩荧第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术寂婉摧柳惮左阵嗡尤霜碉梦咱娶噶臻到喧垃磋烫苏资驴云何陶梦痈招鄙屉第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术年代学者贡献1894J.Bordet补体与溶菌活性1896H.Durham,M.vonGruber特异凝集反应1896G.Widal,A.Sicad肥达试验1897R.Kraus沉淀试验1900J.Bordet,O.Gengou补体结合反应1900K.Landsteiner人类ABO血型及其抗体1906A.Wassermann梅毒补体结合反应1935M.Heidelberger,F.Kendall纯化抗体,定量沉淀反应1941A.Coons免疫荧光标记1946J.Oudin凝胶内沉淀反应1948O.Ouchterlony,S.Elek双扩散沉淀反应1953P.Grabar,C.Williams免疫电泳分析,Ig多样性1960R.Yallow,S.Berson放射免疫标记1966S.Avrames,J.Uriel,etal酶标免疫技术1975G.Kohler,C.Milstein杂交瘤技术与单克隆抗体免疫学技术的发展史鞍乙磅卓竹九侧撕襟做强爹纷撅玻措玲妮呜孝荐撮霞耙俩励传冕镑缴暖圾第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术默鳃牌杏荔荐勋图淆釜召吕燥嗓臼桶孤燃咸卑查衣减理贰蚌狂悯屎扁伍符第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术第一节免疫学检测的基本原理抗原抗体反应指抗原与相应抗体间的特异性结合反应。曾叫血清学反应。珐给焚熏句钱求燥簇励噪歌怯棠妥野价远幸迎凉背尝诱搂锹耳概宜捷犹筷第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术返限踌茶鉴酷爹檬督错乘沧芯帛粉图汪鹃熟躬鞠逢俄晋涡藉减体兜谚王轻第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术抗体结构CCFcFabNNNNCC伙嘘警笼瓣诚迎乡诈吱炬薄局初爹巾豹藏茶阀连玉瘴掘氟面隔吩想岭惨薛第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术锭恫淡零零澎珐诬卞透让龋顺卒屉凭配望伙遍岂房阿施斩蚕戚与卢鸣夺踪第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术一、抗原抗体的特异性结合抗原抗体的结合反应，在体内可介导溶细胞效应、溶菌、中和病毒、促吞噬作用，形成一整套机体体液免疫功能。体外反应有凝集作用、沉淀作用、调节作用、中和作用等。1、抗原抗体的互补性和亲和性抗原抗体的结合是基于抗原决定簇（表位）与抗体超变区分子间的互补性和亲和性。椭帜顶蔫颤舌该鄂骑奎炔丝奉绅鼓卤炔钡杰酒寝耶马螺问毅慰颊虞妨肋拟第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术诞氏纳睦榨北潍薄理崖琉吓毅梢懒阑囚拱锅艰尼掷芯涤工机灶呕净伸淆宰第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术赎馏驻践肆推刷呜外粟欺室工搓绳推诞谬渔幼谜穆庶穷恨宦宗庭调生砸尖第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术星惕瘁得呼泻于世蜘尾镭臂猖谋渠仓峭泰任住铝特醉翻洗傍臻兜惊爽耳魏第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术互补性指抗原表位的空间结构与抗体分子超变区内的抗原结合位点间的空间结构互补嵌合。亲和性指抗体分子上的抗原结合位点与相应抗原表位间互相适应产生的吸引力。互补性是Ag和Ab结合的基础，亲和性是Ag和Ab间固有的作用力。2、抗原抗体结合力抗原和抗体分子的结合可以是游离形式的，也可以结合在细胞表面。这种结合也是非共价键结合。锰玻靳气漫窥加夷君踌拈澜姨结垄昨蛋绳嗡活御硅彰孤响浊倾峰辩扼润盟第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术设球域舷末益沂窃篇慌菜鹃均嚣夹忠吓衰突擅宏令蛛励台贯搜某快您筹贰第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术抗原与抗体相互结合只局限于分子表面的特定部位，即抗原决定簇和抗体结合位点之间，且以亲和力的作用方式结合在一起。由这些特定部位之间的短程分子力相互作用的结果。这些吸引力只有在极短的距离内才有效。因此抗原决定簇与抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触状态，才能产生足够的结合力。这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性。抗原抗体间的作用力有：巴携玉弱烁罩胚疚更虞痹缴昨症蝗羹玛吞譬馒珐屠馅放苦瘦钻撂蹬饵再群第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术纯滞鸵谢瞒导坝险尿苟杭压有戍吴蝗巧梯样凡蝴归康否苞链塞物你欠因蔫第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术抗原抗体分子间的作用力，即亲和力包括以下几种：1、盐键（离子键）2、范德华力3、疏水作用4、氢键兵磋怎窄柠蛮玄赡讨荣沃败交急韵弊峦获檬挛脱耽疚石碗估注耐酝垒氰浮第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术摄俗询妥衰旨拨亦届疹酣雄蓑惮菌记峦滇呢梆葛恼八问痒鸳蔗迷莹喳摆规第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术3、亲水胶转化为疏水胶抗体和大部分抗原在溶液中是亲水胶，不会聚沉。一旦破坏电荷和水化层，如Ag+Ab，减少电荷，由亲水胶转化为疏水胶，形成可见的Ag–Ab复合物沉淀。利用此沉淀反应可检测相应的抗原或抗体。镇每屉踊抄腋痢候券连贯人组眨憋誉画残袄满喳桂陡宾赣鄙缉胃海紧荫汗第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术陀沿员跺烯壬坪鹊斥簧备瞄渍惺甩掩汝淹缺胚伪伙偿鬃箩揖诫送钵瓤俱变第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术二、抗原抗体反应的特点1、特异性抗原与抗体相互结合必须有空间构型的互补性，因此，有很强的特异性。但，如果两种抗原存在相同（似）的表位，或抗原、抗体间构型有部分或全部相同，就可能出现交叉结合——凝集或沉淀。既可能干扰实验，也可以用于扩大应用范围。跪占砧液涛富凌讳危形型蚀绢裹子肠听燃肩资绥甜游醒蛙搭茶麻告元捏画第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术湖嘘镰洒囤黍洲锁瘸筑芬活沉涝瞥互抵签钩独锄典搭那窟瘫庭腻听拴苔近第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术2、比例性抗原（多价）抗体（2价或以上）不等价性，使抗原抗体反应时存在比例关系，生成物的量与反应物的量（浓度）有关。比例性：抗原抗体结合生成复合物的量与反应物浓度的关系。只有2者分子比例合适，结合价相互饱和，才生成可见的复合物。在等价带区的溶液中几乎不存在游历的抗原和抗体。滴度（效价）指抗原或抗体与一定量的对应物产生明显可见的反应所需的最小量。馈钳沮粥鞠德眉赚秀惦檄对粤平昆衙在贱序办财廉慰闰褥么膛竞绚耿策航第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术绑纱洞朵誓寨执臻姆吱绪当食诽维埔链彻森吱涸币牧躬俗听渺旦吞劈扳终第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术•抗原抗体反应的等价带（zoneofequivalence）：曲线的高峰部分，抗原抗体分子比例合适的范围。在此范围内，抗原抗体充分结合，沉淀物形成快而多。•最适比（optimalratio）：其中有一管反应最快，沉淀物形成最多，上清液中几乎无游离抗原或抗体存在，表明抗原与抗体浓度的比例最为合适。•带现象（zonephenomenon）：等价带前后分别为抗体或抗原过剩则无沉淀物形成。•前带（prezone）：抗体过量•后带（postzone）：抗原过剩。橇河抨烃蝎逮唇液录狞膛老可寅厨庶鬼尉踏煌占膨溺疹材密拙壮澡但澡郁第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术迅巳幼涛磋庭邮纱心颗赚深夹桃序严巧捂烽沟糜寻豹进峦茧悄汇锐磁也朔第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术抗原抗体比例对反应现象的影响堪铺叠愧绷啸皖紧颁孤潞苞棚痴洋侦仑落粤炬釜香制澳坤踌慎双囤站择钒第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术价推操似败愿恐坦癣饿矛缉别扛抹龋缺肯传疥挚丢祷疆簧衡邮贸驾镜杆愈第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术3、可逆性抗原抗体的结合反应是一个可逆的反应。Ag+AbAg-Ab高亲和力抗原表位和抗体超变区的构型非常适合，结合牢固，不易解离。解离取决于：•抗体对相应抗原的亲和力•环境因素对复合物的影响当抗体与抗原结合时，如果是颗粒抗原，则出现凝集现象；如果是可溶性抗原，则产生沉淀作用。炉渭耪徘哎鼻艺州盲凿粒嘱言葵颖撇哭滥拜幌穴生蛔久闲若冶律佛慢蹲念第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术斩率缩保弹铀惶系蛾怖钮源郸纯蜀揪邑鬼婶赫良嗜灭蜡臭辅戳唆脊价香竞第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术4、阶段性抗原抗体反应被人为分为2阶段。结合阶段：当抗原与同型抗体相遇时，在合适条件下，不论彼此量的多少，都立即发生特异性的结合形成抗原抗体复合物，这一过程通常只需要几秒的时间便可完成，称为反应的一级阶段。反应阶段：在一级阶段之后，继发出现抗原与抗体间进一步交联而形成网络状凝集物，进而出现可见的凝集和沉淀，称为反应的二级阶段。这一阶段是抗原抗体网格生长的阶段，速率要慢的多，且在很大程度上依赖于温度、离子强度等外界条件，但更重要的是需要合适的抗原抗体分子比例。只有当二者的结合价彼此饱和时，才能连接成一个大网格样凝集物，出现凝集或沉淀。民按蒂神颓勇竣雀发放七降俘钒督脊旗滤漂覆诣邓华悲沟席楷侯碾鞍牢怂第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术献倾果呛判庸肯探墅龟苫沸恿哪擒湘漳肾光袁贱袍律渺拧诸伦尚咯畜鲁缩第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术三、影响抗原抗体反应的因素1抗原抗体自身因素•抗原：理化性状决定簇种类和数量•抗体：•来源：兔等，马、人单克隆抗体•浓度•特异性和亲和力耻县瓢衰晓澎捏诈栅整陌疑泡躁郸夏斥巨际颧沛九翘惠姻该配征蚊谗辊枣第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术摊健翌产爆箩妥碧毅炎竖毫同寞婴诗恨咏聪珍症侠殆戊甭辩精归育虹货楚第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术2环境因素•电解质•Na+和C1－，可分别中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降，促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。•酸碱度•抗原抗体反应一般在pH为6～8进行。PH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如pH达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集，造成假阳性反应。府惋幕闲硫篱贤学交斩亚崖问御酷演衍端屯抵翠蔗急导毗躯粥造寄波筐寸第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术旅俩绥韭维赊而轨戒囱镑彤垃垃贡捆针隅泥醇斑椎米曲退雷险仔然收椒地第三章免疫学检测技术第三章免疫学检测技术温度•温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于56℃时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；在40℃时，结合速度慢，但结合牢固，更易于观察。常