DNA操作的基本技术

目录目录1DNA操作的基本技术TheBasicTechnologiesforDNAManipulations目录2第一节核酸印迹技术与分子杂交NucleicAcidBlottingandMolecularHybridization目录3什么是核酸分子杂交•核酸分子杂交（nucleotidemolecularhybridization）–以DNA的变性、复性为理论基础–指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程目录4一、Southern印迹可用于分析基因拷贝数的变化•由E.M.Southern在1975年提出•可用于分析基因拷贝数的变化•基本操作过程包括–待测DNA样品的制备和基因探针的标记；–待测DNA样品的电泳分离；–电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物；–特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或显色检测目的DNA的存在。目录5Southern印迹分析基本流程滤纸NC膜凝胶滤纸电泳转移杂交，显影酶切DNA样品上样DNA印迹重物缓冲液目录6二、Northern印迹和RT-PCR可用于分析基因转录水平的变化•Northernblot是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析mRNA的常用方法；•RT-PCR是以mRNA为模板反转录合成cDNA、再以cDNA为模板进行特异性扩增，进行RNA定性或定量分析的一种方法；•二者均可用于分析基因转录水平的变化。目录7三、原位分子杂交技术可用于基因及其表达产物的定位分析•原位杂交（insituhybridization，ISH）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；•可用于基因及其表达产物的定位分析。目录8（一）利用原位杂交技术进行基因定位分析•荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）•基因组原位杂交（genomeinsituhybridization，GISH）目录9FISH箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置目录10（二）利用原位杂交技术确定特定基因的表达定位•RNA原位杂交•整体原位杂交（Wholemountinsituhybridization,WISH）目录11第二节聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction目录12什么是聚合酶链式反应•聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）–是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；–由K.Mullis于1983年建立；–可用于分析基因及其产物的水平变化；–可进行实时、定量分析；–可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列的相互作用。目录13PCR技术的工作原理5`3`3`5`5`3`3`5`++5`5`变性、退火引物5`3`3`5`+5`5`dNTPsTaqDNA聚合酶不同长度新链DNA循环1+引物变性、退火目录1425～30次循环后，模板DNA得到扩增5`3`3`5`+5`3`3`5`++5`3`3`5`+5`3`3`5`++dNTPTaqDNA聚合酶均一长度新链DNA循环2目录15一、PCR技术分析基因及其产物•反转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。•RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。目录16mRNA5AAAAAA(n)3mRNA5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5mRNA5cDNA3AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5oligo(dT)12-18反转录酶RNaseHDNA聚合酶S1核酸酶3cDNATTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5反转录合成cDNA目录17二、PCR技术可以进行实时、定量分析QR3'3'5'5'上游引物下游引物荧光标记引物RQ3'3'5'5'7版目录18三、PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的DNA序列7版目录19第三节DNA序列测定DNASequencing目录20*DNA序列分析方法的演变和发展•20世纪70年代–双脱氧链终止法：F.Sanger–化学裂解法：A.Maxam和W.Gilbert•20世纪80年代–PCR及自动测序技术目录21一、DNA序列分析有双脱氧链终止法和化学裂解法•（一）Sanger双脱氧链终止法利用2′，3′-双脱氧核苷酸掺入中•（二）Maxam-Gilbert化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基止聚合反应目录22双脱氧链终止法7版目录237版GATC测序反应电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'3'正极负极ddGddAddTddC目录24DNA序列自动分析ddG红ddTddA绿ddC蓝橙毛细管电泳荧光标记DNA合成测序结果展示目录25二、DNA序列分析可以揭示基因和基因组一级结构变化•通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异•通过DNA序列测定分析人工重组的基因•通过DNA序列测定对定点突变进行确认目录26第四节DNA芯片技术DNAChipTechnologies目录27什么是DNA芯片技术•DNA芯片（DNAchip）–在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；–通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达)；–亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。目录28基因芯片工作流程7版目录29一、利用DNA芯片技术可同时进行高通量基因转录活性的分析•cDNA芯片每个探针是cDNA片段或基因的一段PCR产物，可以同任何具有同源序列的样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表达。•寡核苷酸芯片利用基因特异的寡核苷酸片段为探针，每个基因有10~20个相对应的探针，对低丰度基因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。目录30二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合检测蛋白质-DNA相互作用•染色质免疫共沉淀-芯片（chromatinimmunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip）–特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，解交联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，再用于芯片分析；–寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。（一）ChIP-on-chip的基本原理是染色质免疫共沉淀与芯片技术相结合目录31ChIP-on-chip工作原理甲醛处理使细胞内蛋白质和DNA交联超声波打碎特异性抗体免疫沉淀目的DNA片段纯化、扩增荧光标记和芯片检测芯片数据分析目录32（二）采用两步模型法进行ChIP-on-chip数据分析•两步模型法（two-stepparadigm），可以从利用ChIP-on-chip获得的大量复杂数据中，经过聚类、挖掘、分析，得到有效的数据及信息，特别是可以获得大量的转录因子在基因组上结合位点的信息。•第一步在获得的数据中抽取转录因子结合位点处500~1000bp左右的序列信息，然后在这些序列中进行模式比对，寻找可能的模体（motif），获得粗略的目的数据集。•第二步对其进行数据挖掘和分析。目录33（三）ChIP-on-chip适于DNA-核蛋白相互作用及表观遗传学研究•主要集中在两个领域：•第一，确定转录因子及其作用位点：能够将直接与蛋白结合的基因作为靶点，数据可以直接用于生物信息学分析，更直接地识别转录因子结合元件。•第二，确定基因表观遗传修饰，应用于表观遗传学研究。–表观遗传学的主要研究内容包括甲基化，组蛋白修饰和染色质重塑等。–ChIP-on-chip技术可提供基因编码区中组蛋白甲基化分布模式的信息：CpG岛表达序列标签芯片，可以显示基因组内CpG甲基化和组蛋白修饰之间的联系目录34三、芯片技术的发展——蛋白质芯片和组织芯片•蛋白质芯片技术是研究蛋白质组学的有力工具–蛋白质检测芯片–蛋白质功能芯片•组织芯片是以形态学为基础进行高通量检测基因表达信息的芯片技术–多组织片–组织阵列–组织微阵列目录35第五节酵母及哺乳动物细胞杂交系统YeastandMammalianHybridSystems目录36一、酵母双杂交探测蛋白-蛋白的相互作用•酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）由S.Fields和O.Song于1989年提出并初步建立目录37酵母双杂交技术的基本原理目录38（一）酵母双杂交系统利用报告基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用（二）酵母双杂交可通过蛋白质相互作用鉴定/分离新的相互作用蛋白及其编码基因（三）哺乳动物双杂交系统是在酵母双杂交系统基础上发展的目录39二、酵母单杂交系统需要构建“报告”细胞•酵母单杂交技术（yeastone-hybrid）由J.Li于1993年从酵母双杂交技术发展而来–是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法；–通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因。目录40酵母单杂交技术的基本原理目录41三、蛋白质-RNA相互作用也可采用酵母三杂交系统进行分析•酵母三杂交系统（yeastthree-hybridsystem）于1996年由D.J.SenGupta等首先报道（一）用于蛋白质-RNA相互作用分析的酵母三杂交系统需要杂合RNA目录42酵母三杂交基本原理目录43（二）酵母三杂交系统应用范围广泛•可进行与特定蛋白结合的未知RNA的筛选；•确定RNA-蛋白质相互作用的结构域；•鉴定、分离能够识别具有重要生理功能RNA的RNA结合蛋白。