色谱-质谱联用技术

色谱-质谱联用技术戴琛生命科学实验中心生物化学与分子生物学系Tel:84390590,13584020128Email:[e-mail]相关参考书目授课内容色谱-质谱联用技术原理LTQOrbitrap仪器应用领域实验设计色谱简介色谱法由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，加入石油醚使自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带，因得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来含义，但仍被人们沿用至今。色谱的原理定义：色谱是一种把混合物中多组分分离的实验技术。即利用化合物的物理化学性质建立的分离分析方法。实质：分离目的：定性或定量分析固定相和流动相填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。按分离机理分类分配色谱：利用在流动相和固定相中分配系数的不同分离；吸附色谱：利用物理吸附性能的差异分离；离子交换色谱：利用离子交换能力的差别分离；空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同分离…在常用的色谱中，常是几种分离机制共同作用的结果。注意气相色谱在柱温条件下有一定蒸气压且稳定性好的样品都能测定，只要在–196~450℃温度范围内有27~1330Pa蒸气压且不分解的物质原则上都能测定，不论它是气体、液体和固体。对于挥发性低和受热易分解的物质，若能通过化学衍生方法使其转化为挥发性大、热稳定性好的衍生物，同样可用气相色谱分离和分析。GC专长：同系物GC主要用于分离和定量，可广泛应用在环保、临床、药物、农药、食品、污染物等方面的测定。液相色谱对不宜汽化的高分子，热稳定性差、化学性质极为活泼或强腐蚀性物质不能用GC测定。应用范围受到限制，在所有的有机物分析中只有15~20%能用GC进行分离分析。对于极性和高分子量化合物，液相色谱（LC）则是其关键的分离技术。色谱峰所能提供的重要信息1样品中所含组分的最少个数2保留值---定性分析3色谱峰面积（或峰高）---定量分析4色谱峰的保留值和区域宽度---评价色谱柱的分离效能5根据相邻色谱峰之间的距离来选择合适的色谱分离条件保留时间反相色谱C18，C8，CN极性大的组分先出峰，极性小的组分后出峰。正相色谱NH2，硅胶柱，CN极性大的组分后出峰，极性小的组分先出峰。常见HPLC检测器UVDAD荧光Q：UV检测器是不是通用检测器？UV：共轭体系FLD：1共轭双键体系2刚性平面结构3给电子取代基质谱基本知识什么是质谱？质谱分析法是通过对被测样品离子质荷比（m/z）的测定来进行分析的一种方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场运动行为的不同，把离子按m/z分开而得到质谱，并得到样品的定性定量结果。m/z15294357859911314271如何理解质谱的发展40年代同位素测定和无机元素分析50年代有机物分析60年代气相色谱-质谱联用80年代新的质谱技术接口技术（基质辅助激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学电离源）新质谱仪（液相色谱-质谱联用仪，傅里叶变换质谱仪等）目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。1911年世界第一台质谱装置（J.J.Thomson）70年代计算机技术引入质谱特点◆质谱不属波谱范围；◆质谱为通用型检测器；◆质谱是分子离子及碎片离子的质量与其相对强度的谱,谱图与分子结构有关；◆质谱法进样量少,灵敏度高,分析速度快；◆质谱法可提供分子量,确定分子式。质谱简化流程（GMSD）质谱仪的基本结构质谱仪包括进样系统、电离系统、质量分析系统和检测系统。计算机数据处理系统真空系统加速区进样系统离子源质量分析器检测器真空系统质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用分子泵可获得更高的真空度。二级真空系统！真空系统为早期的维护反馈提供数字化控制双分子涡轮泵可快速抽真空和进行稳定操作进样系统进样系统目的是高效重复地将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低。进样方式：1直接进样2仪器联用的进样（GC、LC、CE）为什么质谱要与色谱联用？LC灵敏度：ug/mL~mg/mLUV检测器缺乏通用性MS灵敏度：pg/mL~ng/mL高选择性，以m/z进行区分直接进样需要一定的纯度色谱的分离能力质谱的定性功能实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。长期以来，LC与MS联用被认为是“不可能的结合”传统的HPLC系统中遇到的流量（0.5～2mL/min的正、反相溶剂流速）和质谱仪要求的真空之间存在的难以协调性似乎太大了。将流量达2mL/min的液体引进MS的真空系统需要使用一个合适的接口离子源（接口）作用Desolvatesampleflowforintroductionintomassspectrometer.（去溶剂）BafflethefirstvacuumregionoftheMSfromatmosphericpressureinthesource.(真空过渡)Ionizetheanalyteortransportioninsolutiontothegasphase.（离子化）Pumpawayneutralsandoppositechargedionswhichwouldotherwiseinterferewiththeanalysisofthedesiredpolarity.（去除干扰）离子源类型电子轰击电离源electronimpactionizationsource,EI化学电离源chemicalionizationsource,CI快原子轰击电离源fastatombombardmentsource,FAB电喷雾电离源electrosprayionizationsource,ESI大气压化学电离源atmosphericpressurechemicalionizationsource,APCI基质辅助激光解析电离源Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization,MALDI电子轰击电离EIEI源主要用于挥发性样品的电离（GC-MS）。原理：由GC或直接进样杆进入的样品，以气体形式进入离子源，由灯丝发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离。所有的标准质谱图都是在70eV下做出的。有机物分子可能被打掉一个电子形成分子离子，也可能会发生化学键的断裂形成碎片离子。由分子离子可以确定化合物分子量，由碎片离子可以得到化合物的结构信息。EI源特点1）结构简单，稳定，电离效率高，易于实现；2）质谱图再现性好，便于计算机检索及比较；3）离子碎片多，可提供较多的分子结构信息。4）当样品分子稳定性不高时，分子离子峰的强度低，甚至不存在分子离子峰。ESI电喷雾电离源ESI喷嘴横截面ESIESI源结构ESI源特点离子在液相产生软电离模式,可给出分子离子峰有益于热不稳定化合物的分析有益于中等到高等极性化合物分析有益于大分子（蛋白/多肽）带多电荷大气压化学电离源（APCI）APCI源结构APCIAPCI源特点离子在气态产生不利于热不稳定化合物的分析有益于低极性到中等极性化合物的分析适合小分子（steroids-类固醇,甾体化合物）比ESI更能容忍缓冲盐软电离模式，仅产生单电荷离子离子化技术应用覆盖基质辅助激光解析电离源MALDIMALDI适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。可得到准分子离子峰，碎片离子和多电荷离子较少.MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。质量分析器质量分析器是质谱仪的核心,质量分析器的作用是将离子源产生的离子按m/z顺序进行分离并排列。目前常用的质量分析器有：磁质量分析器（MagneticSectorAnalyzer）四极杆质量分析器（quadrupolemassanalyzer）飞行时间质量分析器（timeofflight,TOF）离子阱质量分析器（iontrap）单聚焦磁场分析器41在一定的B、V下，不同m/z的离子其R不同，由离子源产生的离子，经过分析器后可实现质量分离。离子进入分析器后，由于磁场的作用，其运动轨道发生偏转改作圆周运动。其运动轨道半径R可由下式表示：上式中，m-离子质量Z-离子电荷量V-离子加速电压B-磁感应强度四极杆质量分析器传统的四极杆质量分析器是由四根笔直的棒状电极与轴线平行并等距离的置悬着构成，棒的理想表面为双曲面。在一定DC/VC作用下，只有m/z满足一定要求的离子才能通过四极杆到达检测器，其他离子被滤掉。++++四极杆质量分析器示意图四极杆质量分析器具有重量轻、体积小、造价低廉等优点。飞行时间质量分析器用一个脉冲将离子源中的离子瞬间引出，经加速电压加速，它们具有相同的动能进入漂移管，质荷比小的离子具有最快的速度因而首先到达检测器，质荷比大的离子则最后到达检测器。IonSourceDriftRegionDetectorReflection特点：1）检测离子的质荷比范围非常宽；2）灵敏度高，适合于作串联质谱的第二级；3）扫描速度快，适合研究极快过程。检测系统质谱仪常用的检测器有直接电检测器、电子倍增器、闪烁检测器和微通道板等。电子倍增器运用质量分析器出来的离子轰击电子倍增管的阴极表面，使其发射出二次电子，再用二次电子依次轰击一系列电极，使二次电子获得不断倍增，最后由阳极接受电子流，使离子束信号得到放大。电子倍增器示意图数据处理系统质谱仪都配有完善的计算机系统，不仅能快速准确的采集数据和处理数据，而且能监控质谱仪各单元的工作状态，实现质谱仪的全自动操作，并能代替人工进行化合物的定性和定量分析软件：XcaliburPDMetaboliteID质谱术语质荷比(m/z):离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值。峰(Peak):质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰。离子丰度:检测器检测到的离子信号强度。基峰(BasePeak):在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰。总离子流图(TotalIonsChromatography,TIC):在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间所作的图。准分子离子:指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量.液质中最常见的准分子离子峰是[M+H]+或[M-H]-。在ESI中，往往生成质量大于分子量的离子如M-1,M+1,M+23,M+39,M+45......称准分子离子,表示为:[M-H]-,[M+H]+,[M+Na]+,[M+K]+,[M+HCOOH-H]-等碎片离子。碎片离子：准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子。碎片峰的数目及其丰度与分子结构有关,数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的碎片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该离子高分辨质谱：泛指分辨率超过104的质谱，能测出化合物精确到小数点后4位的分子量，且误差小于5ppm。目前主要有飞行时间质谱（TOF/MS），轨道阱质谱（Orbitrap），傅立叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR/MS）。总离子流图在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间所作的图。LC-MS&LC-MSnLTQOrbitrap二维