饲料用酶的研究进展 姚斌

中国农业科学院饲料研究所杨培龙姚斌2009年10月18日饲料用酶的研究进展饲料用酶制剂一种新型的饲料添加剂，可提高动物的生产性能、降低饲料成本、减轻环境污染及开发新型的饲料资源。植酸酶、淀粉酶、木聚糖酶、b-甘露聚糖酶、b-葡聚糖酶、a-半乳糖苷酶、脂肪酶、角蛋白酶、葡萄糖氧化酶、霉菌毒素降解酶、溶菌酶等饲料用酶种类对动物内源酶进行补充的饲料用酶,如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等消除饲料中的抗营养因子的饲料用酶,如b-葡聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、b-半乳糖苷酶等使某些营养物质得到更有效的吸收利用、提高低劣质饲料成份的营养价值的饲料用酶,如纤维素酶、木质素酶、植酸酶、果胶酶、角蛋白酶等毒素、有害微生物去除的饲料用酶，如霉菌毒素降解酶、有机磷农药降解酶、溶菌酶等饲料用酶的意义1.缓解饲料资源短缺2015年,缺口将达0.5亿吨★提高饲料利用率,节约并开发新的资源2.减轻环境污染排放量(万吨/年)P:250N500★N、P排放量降低40%以上3.提供更为安全的动物产品具有控制、预防动物疾病★减少抗生素、化学添加剂的使用4.提高养殖业综合经济效益★降低饲料成本;降低料肉比;提高增重饲料用酶现状九十年代才开始规模应用,2008年市场值达到3亿美元,酶制剂中年增长最快的。以饲料用酶为主体的生物工程产品在饲料中占饲料价值的20%,却决定了80%的饲料质量目前b-葡聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶等多个酶种已得到了一定程度的应用但与别的饲料添加剂相比,饲料酶的应用还处于婴儿期,全球只有不足30%饲料在应用原因一、酶的性质不能满足要求饲料用酶需同时具备以下优良性质:热稳定性好而同时在常温下又具有高活性最适pH在酸性同时在整个酸性和中性的pH范围内又能维持较高活性对动物胃、胰蛋白酶和别的蛋白酶具有较好的抗性等综合性质原因二、饲料用酶的生产成本饲料用酶仅是众多饲料添加剂中的一类,决定了其添加成本必须十分低廉。国内外差距研究与应用起步较晚，差距较大。除少数产品外,普遍存在生产技术水平低、品种少、应用技术不完善等问题。国外已有十余种酶制剂实现了产业化,并在包括中国的市场上销售和应用。生产成本高。国外80%以上的饲料酶制剂是利用基因工程菌株高效生产,而我国仅有植酸酶等少数几种是利用基因工程菌株高效生产,而大部分酶制剂是采用天然和诱变菌株发酵生产,成本高。国内外差距酶的有效性差，应用效果不稳定。酶的性质不够理想；非单酶生产，各种酶的相对比例难以控制,质量标准难以控制,造成使用时效果不稳定、重复性差。酶的配套应用技术体系不完善。缺乏针对我国饲料日粮和动物特征的应用技术。研发趋势注重资源挖掘,尤其是微生物资源。利用现代分子生物学和生物技术手段,高通量筛选饲料用酶微生物及相关基因资源,近来特殊环境微生物成为重点目标。利用基因工程、代谢工程技术,构建高效生物反应器技术平台,使饲料酶的单位产量成百上千倍的提高,以期规模化廉价生产,以解决饲料添加剂添加成本空间有限的问题。研发趋势发酵技术和产品加工平台技术。重点针对几种主要的饲料微生物反应器,如酵母、曲霉、芽孢杆菌等,建立高效的高密度发酵方法,并开发高效稳定的产品加工技术,提高饲料生物制剂的稳定性、实用性和应用的高效性。饲料生物制剂的应用效果快速评估系统和配套应用技术体系研究。我们的研发和产业化进展中国农业科学院饲料研究所微生物工程研究室简介•成立于1994年•国内饲料科学研究中第一个分子生物学和基因工程实验室。•研究内容:饲料和工业用酶及其它生物活性物质的研发动物胃肠道微生物及基因的分子生态鱼的分子免疫与基因工程疫苗饲料用酶的研究平台技术平台的建立•新酶及基因的高通量筛选平台技术•有效的分子改良平台技术•高效表达平台技术•发酵技术和规模化生产技术基因资源–新酶、新基因的高通量筛选特殊环境冰川土样雪莲根部土样地方羊品种瘤胃草鱼胃肠道天牛胃肠道深海鱼胃肠道棉桨废水金属矿废水热泉火焰山土样特定环境样品环境微生物DNA提取宏基因组文库构建目标基因表达筛选全长基因获得基因高效表达酶蛋白纯化性质鉴定与评价生物信息学分析目标酶基因PCR引物组合设计酶基因片段获得基因多样性分析及新颖性评估特异PCR引物或特异探针菌落PCR或菌落杂交筛选产酶菌株定向筛选菌株纯化产酶验证菌株鉴定基因克隆基因筛选克隆技术路线主要结果•基本建立了从特殊环境中快速筛选新酶编码基因的有效方法体系•构建了一种无需建库和分离微生物而直接从环境基因组中克隆全长基因的方法•研究了10余种特殊环境的微生物多样性•分离到300株以上的产目标酶酶微生物，其中有5个新种，10余个潜在的新种•研究了8种目标酶在多个特殊环境中的基因多样性•克隆到了超过2000个的目标酶基因片段•克隆到了300个以上的全长新基因主要结果筛选到了大量的性质各异、具有重要应用价值的酶及基因可加深我们对酶关键性质与结构功能的了解,指导进一步的分子改良–综合性质极为优良的植酸酶、木聚糖酶、b-甘露聚糖酶等–具有特殊性质的酶:如低温酶、高温酶、高比活性酶、强酸性酶、强碱性酶、抗蛋白酶降解的酶等雪莲根部土壤低温脂肪酶基因片段进化树图谱进化树显示为五个独立分开的进化簇，说明冰川土壤中的脂肪酶基因序列呈现出多样性的特点●HSL家族脂肪酶作为参考序列DiversityofBPPgenefragmentsfromgrasscarpdigestivetracts冰川土样中第10族木聚糖酶多样性分析•F10•F37•0.02结构具有特点的植酸酶基因•类似于操纵子的ErwiniaherbicolaE3植酸酶基因结构•IMP基因和HAP基因，这两个基因共用一个启动子，IMP基因的终止密码子TAA后，紧接着是HAP基因的起始密码子ATG，在E.herbicolaE5也存在类似的结构•活性研究表明：IMP和HAP都能水解植酸，最适pH都为4.5左右。并且两个酶一起作用时，比两个酶各自单独作用的效果之和更好结构具有特点的植酸酶基因•来源于Pseudomonasfluorescens206串联的植酸酶结构•phytase1全长1284bp，编码了427个氨基酸，phytase2全长1287bp，编码了428个氨基酸•序列之间具有较低的一致性（蛋白序列52.1%）•两个基因在大肠杆菌中都得到活性表达，最适合pH分别为5.0和4.5结构具有特点的植酸酶基因•多个磷代谢相关结构域的N.punctiforme植酸酶基因Nuclease/phosphatasedomainPhytasedomainAlkalinephosphatasedomainCalciumbinding•磷酸酶结构域，植酸酶结构域，碱性磷酸酶结构域，和钙离子结合域•完整的蛋白和单独的植酸酶结构域都能有效的水解植酸•完整蛋白的比活性高于单个植酸酶结构域。作用机制还需要进一步的研究。综合性质优良的植酸酶Y4A.nigerE.coliY4OptimumpH2.5/5.54.54.5OptimumT55℃60℃55℃Specificactivity(U/mg)20031003960Thermostabilityat80℃for30min42%15%54%Pancreaspepsin(2h)39%32.8%82%Stomachpepsin(2h)49%117%87%在低pH值和强胃蛋白酶下高效水解植酸的Y.rohdei植酸酶(猪专用植酸酶)•具备三个必要条件–在强酸性条件下有高活性–强酸稳定性–高浓度胃蛋白酶抗性•该酶同样具有高比活，高的表达量•是猪用植酸酶最好的候选者最适pH比较02040608010012012345678pHRelativePhytaseActivity(%)A.nigerY.pestisY.intermediaY.rohdeiE.colipH稳定性比较02040608010012012345678pHResidualPhytaseActivity(%)A.nigerY.pestisY.intermediaY.rohdeiE.coli胃蛋白酶抗性比较(标准方法)0204060801001201400102030405060Time(min)ResidualPhytaseActivity(%)A.nigerY.pestisY.intermediaY.rohdeiE.coli具有低温活性的E.carotovora植酸酶•具有低温酶典型特性–低温时高的活性–差的热稳定性–在零度时具有5%的活性•最适活性温度，与动物体温相近•首次报道的低温植酸酶•是研究植酸酶结构的优良材料来源于藻类的中性植酸酶•最适钙离子浓度1.5mM•最适pH6.5•最适温度50ºC•具有典型BPP植酸酶的特性–钙离子对该植酸酶的热稳定性和酶活性是必须的瘤胃中性植酸酶CP53•首次从宏基因组中通过改进的TAIL的方法克隆到一致性低的新基因•与报道的CP基因有不同的pH特性（6.5VS4.5）,增加了对的CP植酸酶认识•在中性条件下具有高活性为CP植酸酶的应用研究提供更多的拓展空间Pedobacternyackensis中性植酸酶在pH7.0、20℃时，r-PhyMJ11水解豆粕的能力是A.niger和E.coli植酸酶水解能力的10倍以上以上综合性质优良的木聚糖酶抗多种蛋白酶的木聚糖酶405060708090100110120TrypsinChymtrypsinCollagenaseSubtilisinAProteaseKProleatherAlkalineproteaseProteasesRelativeactivity(%)1h2h高温强酸性木聚糖酶Optimumtemperatureat93Candhighstabilityat90COptimumpH4.0withhighactivityatacidiccondition多个pH峰的木聚糖酶和葡聚糖酶GlucanaseXylanaseSubstrateMainlinkage(monomer)Specificactivity(IU/mg)Relativeactivity(%)Barleyβ-glucan1,3-1,4-β-glucose6000.68100Lichenan1,3-1,4-β-glucose5886.0798.09Laminarin1,3-β-glucose712.8811.88对多种底物有高活性的b-glucanaseBg1抗多种蛋白酶的LipaselipS221020406080100120proleatheralkalineproteasesavinaseproteinaseKtrypsinchymotrypsinsubstilisincollagenaserelativeactivity(%)C0C1C2C3C4低温磷脂酶LIPA010203040506070809010060708090100110120Temperatue/℃Relativeactivity/%pH5.0的高温淀粉酶020406080100345678pHRelativeactivity/%嗜酸性淀粉酶AMY20204060801002.233.23.63.844.24.44.65.25.8pHRelativeactivity/%具有高角蛋白降解活性的蛋白酶Velocity(U/mg0min)Ratio,EnzymeKeratinCaseinKeratin/CaseinSFP259.266.30.89ProteinaseK3438.20.89Trypsin1.400Chymotrypsin1.710.80.16Collagenase000SubstrateAmountofsubstrate(mg)D-Galactosereleased(mg)D-Galactoserelease(%)Melibiose10.427681.3Raffinose10.188962.4Stachyose10.3157.4对多种底物有高活性的a-galactosidaseAGL1抗多种蛋白酶的a-galactosid