第一章 细胞培养的设施与基本条件

复习细胞工程概念课前思考？到目前为止，同学们都学习了哪些专业实验？植物学实验动物学实验生物化学实验微生物实验细胞工程实验室与这些常规实验室相比较的主要区别是什么？离体培养•细胞工程实验室设计–原则防止微生物污染和有害因素影响–要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘划分不同功能区或用铝合金隔板隔开无菌操作区应在室内较少走动的内侧清洗和消毒安置在另室Chapter1细胞培养的设施与基本条件◆细胞工程实验室的设置◆常用仪器与设备◆实验室的生物安全第一节细胞工程实验室的设置动物细胞工程实验室要求严格保持无菌环境，避免微生物及其他有害因素的影响。应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。一、动物细胞工程实验室的设置1．储藏室主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁无尘。还用来储藏什么？要求：取放方便。还有什么要求？2.清洗和消毒灭菌室清洁和消毒灭菌室应与其他区域分开，主要进行所有实验动物材料的处理、细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等工作。应满足哪些要求？3．制备室在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备。应具备什么要求？4.无菌操作室相对密封、防尘、防菌的工作空间，在结构和消毒方面都有具体要求。更衣室：缓冲间无菌操作室a更衣室:供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。要求b缓冲间:位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。c无菌操作室:专用于无菌操作。5.培养与观察室本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进行，后者费用高，一般实验室多采用孵箱进行工作。二、植物细胞培养室的设置◆温度：一般控制在25±2ºC◆光照：光强、光质、光照时间清洗室:制备室：灭菌室：接种室：培养室：鉴定室：驯化移栽室：细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备室；无菌操作室；控制培养室。消毒和实验前的准备两间房实验后污物处理和清洗A、准备室细胞和组织培养所需器具的洗涤、干燥和保存；培养基的配制、分装和灭菌；化学试剂的配制；重蒸馏水的生产等。一般建在通风和光线充足的地方（在向阳面），地面防滑，墙壁防潮。①水槽两处：实验后的清洗及清洁液浸后的清洗。②盛清洁液的陶瓷缸或玻璃缸。③清洗后器皿的凉干架和贮存柜。④高温干燥消毒箱和高压蒸汽消毒锅。⑤消毒后器皿的凉干架和贮存柜。⑥重蒸水装置。⑦电炉⑧工作台⑨污物桶准备室内的常用设备B、无菌操作室密封、防尘、防菌的工作空间。无菌操作室并非无菌，但应该保持清洁。作用：接种，培养物的转移和原生质体的游离培养操作之用。缓冲间接种间C、培养室离体细胞、组织等生长发育的场所，应为培养物创造适宜的生长条件。①培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。②天花板的高度不要超过2.5米，以保证紫外灯的有效杀菌效应，③门一般用拉门，以防止空气流动。④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。•培养室内的无菌操作要点①紫外灯无人时就要打开；②进无菌室要穿无菌服、戴帽子和口罩；③每周清洗消毒一次；④所用物品要以外科手术方式严格消毒；⑤室内台面要要保持洁净；⑥所用物品要一次性准备好；⑦瓶口要用酒精火焰消毒；⑧尽量减少出入。从总体上来分，实验室主要分为两类：基本实验室：辅助实验室：实验室设计准备室接种室培养室细胞学实验室摄影室及暗室生化分析室我系细胞工程实验所涉及的实验室现状506507608609612314课后作业细胞工程实验室与一般实验室的结构区别是什么？请同学们参观完我系现有细胞工程实验室后，从细胞工程实验室结构设置方面对我系现有细胞工程实验室的改建工作提出可行性的建议或意见？第二节常用仪器与设备一、动物与植物细胞工程实验室通用的仪器设备1.培养器皿：培养瓶、培养皿、多孔培养板2.盛装器皿：3.计量器皿：4.超净工作台（净化台）•净化台的工作原理–利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃疯粒，使空气得到净化。•分类④净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰。⑤一般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高效滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。要定期将粗过滤器中的过布（无纺布）拆下清洗，时间应根据环境洁净程度而定，通常间隔3~6个月进行一次。⑥每次使用净化台要及时清除工作台面上的物品，并用洒精擦洗台面使之始终保持洁净。•分类•使用超净工作台应注意的几点问题•①超净工作台最好安装在无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。•②新安装的或长期未使用的工用台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。•③每次使用工作台时，应先用75%酒精擦洗台面，并提前以30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。5.显微镜6.电热干燥箱用于烘干和干热消毒玻璃器皿。消毒时，由于温度高达160℃，因此一般不要随意打开箱门，以免玻璃器皿突然遇到冷空气而破裂。要等温度降低到50℃以下时，才能打开箱门。7.纯水设备8.冰箱超低温冰箱家用冰箱9.蒸汽消毒器10.过滤除菌11.磁力搅拌器12.电子天平13.pH计14.移液设备其它杂品①洒精灯，②煮沸锅，③铝饭盒，④胶塞，⑤胶帽。⑥小推车⑦微波炉⑧水浴锅二.动物细胞工程实验室基本设备仪器1培养箱二氧化碳培养箱，提供恒定CO2（5%）以稳定pH值，温度：哺乳类35℃-37℃，鸟类38.5℃，气相：O2、CO2、pH7.2-7.42显微操作仪3细胞融合仪4细胞冷冻储存器（程序化冷冻仪和液氮罐-196℃）5培养用器皿各种培养瓶、培养皿、多孔培养板（6、24、96）6手术器械等三.植物细胞工程实验室基本设备仪器光照培养箱人工气候室摇床培养瓶第三节实验室的生物安全根据密封程度的不同,将生物安全分为四个等级,即:P1、P2、P3、P4一级生物安全标准，其基本要求是：1、限制随便出入实验室；2、操作前后要消毒；3、不能用口吸取液体；4、禁止在室内进食、吸烟和存放食品；5、操作时着专门实验服；6、处理细胞前后要洗手；7、操作时在超净工作台。作业•自动双重纯水蒸馏器的构造和使用方法和意事项•压力蒸气消毒器的使用方法，物品存放和消毒要求•电热恒温培养箱、电热恒温干燥箱的使用方法•CO2培养箱的供气调节和消毒方法