常用PCR技术基础知识(研究生课程)

PCR基础知识聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polumerasechainreaction，PCR）是依赖于靶DNA序列侧翼上做结合的两个寡核苷酸引物在体外由DNA聚合酶催化合成特异性DNA片段的方法。体内DNA复制体外DNA复制↓变性↓延伸↓退火--------------------------------------------------PCR扩增反应体系模板DNA--扩增起始底物--影响扩增的特异性和产量要求：引物--寡核苷酸片段--决定PCR扩增的特异性和长度要求：特异性好（特别是3’端与模板配对）长度适宜（一般以15bp～30bp为宜）碱基组成分布尽可能随机引物自身或两条引物间无互补结构聚合酶--耐热DNA聚合酶--活性依赖金属离子作用：有5’-3’链延伸活性（合成方向5’-3’）有5’-3’外切酶活性(清楚“阻碍物”）无3’-5’外切酶活性（错配率2.1×10-4）dNTP--合成DNA的原料PCR扩增反应过程变性—通过加热，使双链DNA模板解离成为单链变性温度：由模板DNA双链的G+C含量决定变性时间：由模板DNA分子的长度来决定退火—温度下降，引物与模板互补碱基结合成双链温度计算：Tm=4×（G+C）+2（A+T)温度设置：通常比溶解温度低3-5度延伸—适当温度，DNA聚合酶催化合成新的DNA链最适温度：72-78℃（TaqDNA聚合酶）合成速率：2000bp/min未知基因突变的筛查PCR-单链构象多态性原理：长度相同，但碱基组成顺序不同（甚至单个碱基不同），的DNA单链，非变性条件下形成的空间构象不同，在非变性凝胶中的电泳迁移率不同而表现出的DNA多态性，方法：目的片段扩增扩增产物变性变性产物电泳碱变性：扩增产物NaOH42℃变性5minEDTA热变性：扩增产物SDS煮沸→冰浴→离心EDTA（single-strandconformationpolymorphism，SSCP）PCR扩增产物变性非变性PAGEAAACCCAAACCC注意事项：扩增产物：片段长度400bp—限制酶酶切后在检测扩增的特异性好—调整扩增体系或条件变性处理：避免产物浓度高—合理稀释（1:4或1:6）变性完全且稳定—加样时在冰浴下进行电泳条件：凝胶基质T=8%-10%，C=1.3%-2.6%0.4mm-0.4mm添加剂10%-15%的蔗糖或甘油凝胶温度不加甘油，4℃-10℃添加甘油，20℃-25℃≈原理：同样长度但碱基序列不同的DNA片段其解链区域及各解链区域的解链条件不同，因此它们在凝胶电泳分离过程中，可在变性剂浓度不同的位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在凝胶中被区分开来。方法：PCR-变性梯度凝胶电泳电泳分离PCR扩增用两个引物扩增基因组DNA一条引物：5’端有GC-Clamp凝胶中变性剂呈线性梯度增加变性剂：甲酰胺或尿素变性剂梯度PCR扩增产物主要优点：检出率高：如果突变发生在最先接连的DNA区域检出率可达100%片段较长：最适检测片段长度为100-500bp一般可以检测1000bp注意事项：GC-Clamp：片段长度30-40个GC组成（可以借助计算机程序设定)扩增产物：不宜用于G-C碱基较高（70%）基因突变筛查（可选用SSCP方法进行筛选）突变确定：DNA序列分析(不能确定突变的位置和种类）已知基因突变的检测DNA序列多态性---DNA片段碱基种类差异构成的多态性单个核苷酸的变异所致的DNA序列多态性---单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）原因：碱基的替换（转换或颠换）优点：1.二等位基因---基因频率可以估算2.分布广泛---人类基因组内约有3×106个3.高度稳定---特别是编码区的SNP4.影响产物---编码区的SNP可影响蛋白质表达5.易自动化---提高工作效率PCR-RFLP（限制性片段长度多态性-PCR）原理：不同等位基因的限制性内切酶位点分布不同，其PCR扩增产物用特定限制性内切酶消化后产生的片段的数目和长度不同，形成的电泳谱型不同。方法：--C-------C-------T-------C-------T-------T-----扩增产物酶切片段电泳分离--↓-------↓---------------↓-----------------------SNPAACCGGCTGGAACCTTTTHhaⅠ（GCG↓C）CCCTTT结果判定序列特异性引物-PCR原理：在一定条件下，PCR引物3’末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物，可以通过PCR扩增直接达到区分突变型和野生型的目的。特点：需要三条引物，根据扩增产物的有无判定基因型AACCGGCTGGAACCTTTTCGTA××GA反应体系1反应体系2DNAchip（DNA芯片技术）概念：DNA芯片技术是指同时处理分析大量DNA片段的技术，可用于基因诊断、基因制图、基因表达DNA序列分析。特点：操作简单、自动化程度高、检测效率高应用范围广、成本相对较低原理：DNA分子杂交技术1.载体固定寡核苷酸探针2.靶DNA扩增产物杂交3.杂交信号检测TTCCTCCCGGCTGGAACC短串联重复序列（shorttandemrepeats,STR)错配环位于新生链---减少bp错配位于模板链—增加bp基本特征碱基数目：2bp-6bp2bp最常见4bp最常用重复次数：5次-60次总长度400bp碱基组成：也称基序，[AGAT][GATA]形成原因