实验三 细菌鉴定中的几种生化试验

实验三细菌鉴定中常用的几种生化试验用生化的方法来检测细菌对各种基质的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌种类，这种生化试验称为细菌的生化反应试验；是鉴别细菌的重要依据。细菌的生化试验常见的生化反应碳水化合物代谢试验碳源和氮源利用试验蛋白质和氨基酸代谢试验各种酶类试验糖发酵试验甲基红试验（MR）V-P试验柠檬酸盐利用试验吲哚试验硫化氢试验IMViC试验硝酸还原酶试验，淀粉水解试验内容一、糖发酵试验2、V-P试验1、吲哚试验三、淀粉水解试验二、IMViC试验3、MR试验说明2、本次实验均按传统的生化试验方法进行检测现代快速生化检测1、本次细菌的生化试验仅选择5项代表性试验现代快速生化检测现代快速生化检测采用的方式：简化试剂配制简化操作过程底物，指示剂、抑制剂的改良操作、检测的高度自动化4、自动化微生物鉴定系统现代快速生化检测1、显色培养基3、快速检测试纸2、生化鉴定管海博金黄色葡萄球菌显色培养基环凯沙门氏菌显色培养基显色培养基生化鉴定管柠檬酸盐生化鉴定管木糖生化鉴定管大盒生化鉴定管快速检测试纸使用生化鉴定试剂盒对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌进行细菌鉴定。全自动微生物鉴定系统VITEK®全自动化微生物鉴定系统1、掌握细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法；2.通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况，了解细菌代谢类型的多样性；3、了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。[目的要求]一、糖发酵试验[实验原理]根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。各种糖细菌有机酸（乳酸、醋酸、丙酸等）气体（氢气，二氧化碳等）产酸：指示剂（溴甲酚紫），由紫色（pH6.8以上)变为黄色（pH5.4以下)产气倒置的德汉氏小管二、IMViC试验是一组试验；IMViC是靛基质试验或称吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、V-P试验（V）和柠檬酸盐利用试验（C）的缩写，i是为了发音的需要加上的；常用于革兰氏阴性的肠道细菌检测中，可用于区分产气杆菌属和大肠杆菌属。1、吲哚（靛基质）试验[原理]色氨酸几乎存在所有蛋白质中，某些细菌如大肠杆菌等具有色氨酸酶。蛋白胨中的色氨酸色氨酸酶靛基质（无色吲哚）吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛）玫瑰吲哚（阳性反应）2、V-P试验[原理]葡萄糖丙酮酸缩合乙酰乳酸脱羧乙酰甲基甲醇碱性条件二乙酰与培养基中精氨酸的胍基结合红色化合物（阳性反应）3、MR试验[原理]葡萄糖丙酮酸大量混合酸pH值降至4.5以下培养基变红(阳性反应)甲基红指示剂非酸性末端产物(醇、醛等）pH值＞6.2甲基红指示剂培养基橘黄色(阴性反应)淀粉三、淀粉水解试验[原理]检测细菌是否可以产生分泌到胞外的淀粉酶。淀粉酶糊精，双糖和单糖等碘液不出现蓝色反应，菌落周围呈现透明圈蓝色[实验材料]培养基：葡萄糖发酵培养基，乳糖发酵培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，蛋白胨水培养基，固体淀粉培养基。菌种：大肠杆菌，枯草杆菌，普通变形菌，产气肠杆菌试剂：卢戈氏碘液，甲基红指示剂，40%KOH，5%α-萘酚，吲哚试剂，1.6%溴甲酚紫仪器：略[方法和步骤]1、试管（平板）标记葡萄糖发酵管乳糖发酵管吲哚试验管V-P试验管淀粉水解试验平板：4个各9支用记号笔或者标签纸在平板底部划成或者区分为2部分2、接种培养试管接种：以无菌操作分别接种少量待测菌到以上相应试管中，每菌接2支管,留1管作空白对照不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。葡萄糖和乳糖微量发酵管接种:采用接种针平板接种：以无菌操作分别接种少量待测菌到以上相应平板中,每平板接2种菌,将平板倒置在37℃温箱中培养24h.①确定有无细菌生长？②确定各菌对糖的分解利用情况：不利用：用“－”表示产酸：用“+”表示产酸产气：用⊕表示3、观察记录（直接观察记录或加入试剂反应后再观察记录）糖发酵试验（直接观察记录）1、确定有无细菌生长？2、向蛋白胨水培养液内加入乙醚1-2mL，用力振荡，静置分层后，沿管壁缓缓加入5-10滴吲哚试剂，若上层乙醚层呈玫瑰红色者，为吲哚试验反应阳性。吲哚（靛基质）试验3、“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。1、确定有无细菌生长？并用空试管将葡萄糖蛋白胨水培养液分为2半；2、将其中1半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入5-10滴40%KOH，然后加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15-30min。若培养物呈红色者，为VP试验反应阳性V-P试验3、“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。1、将另一半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变黄色者为阴性。MR试验2、“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。细菌生化实验误差原因？[注意事项]1）纯培养物方可进行生化试验2）严格无菌操作，防止污染情况的发生。4）标记必须准确3）减少试剂因素、其它人为因素的误差[问题和思考]2、你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？3、不利用碘液你怎样证明淀粉水解的存在？1、讨论IMViC试验在微生物学检验上的意义