蛋白质测定-凯氏定氮法

奶粉中蛋白质的测定——凯氏定氮法实验【基础知识】蛋白质概述蛋白质是食品营养价值的重要指标，含N是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。大多数蛋白质含氮量接近，一般来说，pro的平均含氮量为16%，即一份氮相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。注意：不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳及其制品为6.38。【一、实验目的】1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。2、学会使用凯氏定氮装置。3、了解蛋白质系数在蛋白质含量计算中的应用。蛋白质是食品营养价值的重要指标。测量食品中蛋白质的含量对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、指导生产、优化食品配方、提高产品质量具有重要的意义。注意：此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。【二、原理】1、消化仪器及试剂的准备仪器：【三、实验步骤】试剂作用硫酸铜a催化作用：加速有机物的氧化分解。b消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明；c蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑色沉淀硫酸钾提高溶液沸点，从而加快有机物分解浓硫酸氧化作用：有机物质氧化分解为H2O和CO2样品预处理固体试样0.2~2g半固体试样2~5g液体试样10~25g样品充分混匀直接消化样品称量、消化1.000g奶粉0.2g硫酸铜6g硫酸钾20mL浓硫酸玻璃珠小火加热炭化至泡沫完全停止轻摇大火加热保持瓶中液体微沸至蓝绿色澄清透明继续加热0.5～1h冷却加20mL水冷却同时做试剂空白试验2、蒸馏、吸收仪器及试剂的准备仪器：100mL3只试剂（混合指示剂）：2份甲基红乙醇液（1g/L）与1份亚甲基蓝乙醇液（1g/L）临用时混合。指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色。凯氏定氮蒸馏装置传统装置1：电炉2：水蒸气发生器3：螺旋夹4：小玻杯及棒状玻塞5：反应室6：反应室外层7：橡皮管及螺旋夹8：冷凝管9：蒸馏液接收瓶水蒸气发生器：装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇指示剂数滴及硫酸数ml，使水呈微红色（保持酸性以防水中氨的逸出）→按上图所示搭好装置蒸馏及吸收10.0mL硼酸溶液→100mL三角瓶→加1～2滴混合指示剂冷凝管下端插入三角瓶液面下→准确吸取10mL试样→由小玻杯流入反应室→少量水洗涤小漏斗→盖紧玻璃塞→量筒取10.0mLNaOH溶液→倒入小玻杯→提起玻塞使其缓慢流入反应室→立即塞紧玻璃塞→加水于小玻杯防漏气通蒸汽→颜色变化时开始计时蒸馏5min→移动接受瓶使液面离开冷凝管下端→再蒸馏1min→用少量水冲洗冷凝管下端外部→取下接收瓶[注意]①加NaOH一定要过量，此时溶液生成深蓝色或黑色沉淀②为防止样液中氨气逸出。一是要水封，二要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，三要注意接头处有无松漏现象硼酸吸收液的颜色反应室中溶液的颜色③冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸收液温度不应超过40℃，避免氨气逸出，若超过时可置于冷水浴中使用。④在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽,否则会发生倒吸。⑤蒸馏完毕后，先将冷凝管下端离开液面，再蒸1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。⑥所用的试剂溶液必须用无氨蒸馏水配制。3、盐酸滴定接收瓶以HCL标准滴定液滴定灰色终点记录VHcl（1）硼酸吸收液的颜色（2）吸收氨气后的硼酸吸收液的颜色（3）盐酸滴定终点的颜色项目名称检测日期样品名称检验依据内容123空白样品质量m/gV初/mLV终/mL消耗的体积V1/mL吸取消化液体积V3/mL蛋白质含量（g/100g）平均值（g/100g）（g/100g）F：牛乳及其制品的蛋白质换算系数6.38【四、数据记录与计算】有效数字：蛋白质含量≥1g/100g时，结果保留三位有效数字蛋白质含量＜1g/100g时，结果保留两位有效数字。精密度：在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%（g/100g）小结步骤反应前后颜色变化湿法消化凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）→加硫酸炭化黑色→消化后红棕色→棕褐色→消化终点蓝绿色/墨绿色→淡蓝色（冷却后溶液）碱化蒸馏反应室：深蓝色或黑色沉淀硼酸吸收紫红色→绿色盐酸滴定甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色→灰色甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色→蓝紫色凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为粗蛋白质含量。若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶液,使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋白质含量:蛋白氮=总氮-非蛋白氮准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml，移取5ml消化液进行蒸馏，用20ml硼酸吸收，再用0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的蛋白质含量？试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？知识拓展：三聚氰胺假蛋白“原理”三聚氰胺的“优点”1、普通蛋白质含氮量平均为16%，一般不超过30%，而三聚氰胺含氮量为66.7％。2、三聚氰胺为白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现，但是尿素等却有气味，掺入后容易被检测出来若以合格奶粉蛋白质含量为18%计算，则含氮量为2.88%。三聚氰胺含氮量是牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，就能提高0.4%蛋白质。1、先用三氯乙酸溶液处理样品，使其最终浓度为5%,。三氯乙酸能让蛋白质形成沉淀。缺陷弥补2、分别测定沉淀和滤液中的氮含量，就可以知道蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的氮含量