第四章 高效液相色谱(5课时)

21-1概述一、高效液相色谱与气相色谱的比较二、高效液相色谱的分类三、高效液相色谱的特点一、高效液相色谱与气相色谱的比较分析对象流动相色谱柱温度分析对象–气相色谱：气体和沸点较低的化合物，占有机物总数20%–高效液相色谱：高沸点、热稳定性差、分子量大的物质，占有机物总数80%流动相气相色谱流动相：对组分没有亲和力的惰性气体，对分离选择性几乎无影响高效液相色谱流动相：可选用不同极性的液体–选择余地大–对分离影响大（与组分或固定相均作用）色谱柱温气相色谱柱温：一般较高高效液相色谱柱温：通常为室温二、高效液相色谱的分类按分离原理分类：正相色谱反相色谱离子交换色谱尺寸排阻色谱疏水作用色谱亲和色谱手性色谱二、高效液相色谱的分类按分离规模分类：制备色谱柱内径10mm半制备色谱柱内径5-10mm分析型色谱柱内径5mm三、高效液相色谱的特点高压150-350105Pa高速一般1h,1min.高效柱效高高灵敏度10-9g(紫外检测器）10-11g（荧光检测器）•21-2高效液相色谱仪高效液相色谱仪的结构高效液相色谱仪的主要部件21-2高效液相色谱仪一、高效液相色谱仪的结构二、高效液相色谱仪的主要部件高压输液系统进样系统分离系统检测系统附属系统(一）高压输液系统储液罐高压输液泵过滤器压力脉动阻尼器1.储液罐必须有足够的容积与溶剂不发生化学反应便于对溶剂进行脱气不锈钢、玻璃、氟材料容积：500-2000cm3溶剂的过滤与脱气过滤：除去溶剂中的固体微粒脱气：除去溶剂中溶解的气体过滤过滤脱气加热法抽真空吹氦气超声波在线脱气2.高压输液泵对泵性能的要求–输出压力高150-300kg/cm2500kg/cm2–流量范围广0.1--10cm3/min可调–流量稳定无脉动，流量精度0.5%左右–耐腐蚀适用于各种有机溶剂、水、缓冲溶液往复泵单泵与双泵脉动阻尼器过滤器烧结不锈钢材料制成孔径：2-10m（二）进样系统取样和进样功能手动和自动要求：–密封性好–死体积小–重复性好–进样时对色谱系统的压力和流量波动小进样1进样2进样3自动进样器(三)分离系统色谱柱柱箱*色谱柱柱材料：不锈钢柱长度：5-30cm柱内径：2-5mm填料：3-10m填充：匀浆法高效液相色谱柱高效液相色谱柱匀浆法装柱示意图匀浆法装柱示意图色谱柱色谱性能的评价柱效：理论塔板数不对称因子渗透性渗透性渗透性K定义为：PrFLKKKKTT200为柱子的总孔隙率为比渗透率高效液相色谱填料填料热力学特性影响色谱柱的选择性填料的动力学性质或结构特点影响色谱柱的效率–颗粒的大小、形状、均匀性、表面积–孔径、孔体积等。高效液相色谱填料（物理形态）全多孔型（porousparticle)–球形–不规则形无孔小粒径型(non-poroussmallparticle)表面多孔型(porouslayerbeads)贯流型粒子(flow-throughparticle)–贯穿孔(throughpores,600-800nm)–扩散孔(diffusepores,50-150nm)连续床(monolithicstationaryphase)全多孔型（porousparticle)孔的类型微孔孔径2nm中孔孔径50nm,2nm大孔孔径50nm使用中孔和大孔填料微孔易造成色谱峰拖尾表面多孔型(porouslayerbeads)贯流型粒子(flow-throughparticle)色谱用硅胶基质材料硅胶的表面硅胶的化学稳定性硅胶的物理性质多孔硅胶的制备多孔硅胶的表面改性（1）硅胶的表面暴露于表面的Si-O-Si（疏水）硅羟基Si-OH吸附水硅胶表面的硅羟基硅羟基浓度：8.0±0.1mol/m2吸附水(2)硅胶的化学稳定性一般可以耐受酸性介质的侵蚀在纯水中的平衡溶解度100mg/LpH9时溶解度显著增加溶解度与粒径有关（3）硅胶的物理性质颗粒的形状与大小孔径大小及其分布–微孔2nm;中孔(2-50nm);大孔50nm比孔容(mL/g)比表面积机械强度硅烷化试剂氯硅烷烷氧基硅烷(四）检测系统---检测器理想检测器应具有的特点：–灵敏度高–对所有的样品都有响应–对温度和流速波动不敏感–死体积小–对样品无破坏性–对溶剂无响应，能用于梯度洗脱–线性范围宽–重现性好、响应时间快–能给出定性信息溶质性检测器：对被分离组分的物理或化学特性有响应–紫外、荧光、电化学检测器等总体检测器：对试样和流动相总的物理或化学性质有响应–示差折光检测器、电导检测器等检测器的分类几种常用检测器简介紫外光度检测器(ultravioletphotometricdetector)光电二极管阵列检测器(photo-diodearraydetector)荧光检测器(fluorescencedetector)示差折光检测器(differentialrefractiveindexdetector)蒸发光散射检测器（evaporativelightscatteringdetector)电导检测器(electricalconductivitydetector)(1)紫外光度检测器应用最广泛的一种高效液相色谱检测器–约80%的样品固定波长可变波长紫外光度检测器光路图紫外光度检测器光路图(2)光电二极管阵列检测器三维色谱-光谱图光电二极管阵列检测器的主要特点可获得三维色谱-光谱图的检测器三维色谱-光谱图：时间-波长-吸收值–波长范围：190-950nm可同时获得不同波长条件下的色谱图可利用色谱保留值及光谱特征吸收曲线定性可判别色谱峰的纯度及分离状态(3)荧光检测器利用某些试样具有荧光特性建立的检测方法高灵敏度和高选择性（检出限10-12-10-13g/cm3)稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等荧光物质。荧光检测器光路图(4)示差折光检测器连续测定流出液折光指数的变化通用型检测器，但灵敏度较低（10-7g/cm3)–反射式示差折光检测器–偏转式示差折光检测器–干涉式示差折光检测器偏转式示差折光检测器光路图示差折光检测器使用要点流动相组成要恒定（变化值10-6）温度恒定（样品池与参比池的温差±10-4C)压力恒定（检测池不耐压）流速稳定（流量波动5%）不可用于梯度洗脱（5）蒸发光散射检测器通用型检测器–不需要衍生便可检测任何不带发色基团的化合物比示差折光检测器更佳的灵敏度及稳定性对温度变化不敏感可用于梯度洗脱响应值与样品质量有关，对所有样品的检测给出近乎一样的响应因子–测定物质的纯度和定量测定未知物蒸发光散射检测器(ELSD)蒸发光散射检测器工作原理ELSD和RI的基线稳定性及灵敏度比较应用例1应用例2应用例3(6)电导检测器基于物质在某些介质中电离后所产生电导变化进行测定的检测器主要应用于离子色谱受温度影响较大电导检测器结构示意图(7)联用技术HPLC-MSHPLC-NMRHPLC-FTIR(8)梯度淋洗装置低压梯度高压梯度21-5化学键合相色谱采用化学键合相作为固定相的液相色谱称化学键合相色谱法特点：–固定相稳定性好–适合于梯度洗脱–应用范围广化学键合相色谱键合固定相类型键合固定相的制备反相键合相色谱法正相键合相色谱法一、键合固定相类型键合固定相的基质材料主要为硅胶（1）疏水基团不同链长的烷烃（C8,C18）和苯基等（2）极性基团氨丙基、腈乙基、醇和醚等（3）其它基团离子交换基、手性识别基、配基（如酶、抗原、激素等）二、键合固定相的制备（1）硅酸酯二、键合固定相的制备（2）Si-C和Si-N型二、键合固定相的制备（3）硅烷化三、反相键合相色谱法流动相极性大于固定相的色谱法固定相保留机理溶剂强度溶剂选择性流动相及其选择应用例（1）固定相最常用的固定相：–C18(ODS:chemicallybondedoctadecylsilane)C8和其它短链烷烃、苯基键合硅胶固定相ODS示意图（2）保留机理试样组分的流出顺序组分流出顺序为：–疏水性小者先流出–疏水性大者后流出（3）溶剂强度反相液相色谱最常用的溶剂：–甲醇(methanol)、乙腈(acetonitril)、四氢呋喃(tetrahydrofuran)、水用极性参数P表示–极性大，强度弱；极性小，强度强（为什么？）Pmethanol5.1Pacetonitril5.8Ptetrahydrofuran4.0Pwater10.2混合溶剂的强度PAB=APA+BPB（4）溶剂选择性（5）流动相及其选择反相液相色谱流动相的基本组成：水+有机改性剂（甲醇或乙腈或四氢呋喃）选择：–1.用水和甲醇（或乙腈）的混合溶剂为流动相，通过改变混合比优化k–2.等强度更换有机改性剂，提高选择性2/)(121210PPkk流动相选择例（6）应用例高尔夫球场杀虫剂的分离21-6离子交换色谱与离子色谱以离子交换剂为固定相，借助于试样中电离组分对固定在交换剂上的带相反电荷的离解部位亲合力，使其彼此分离。分离对象：在溶液中可电离的物质–无机离子混合物–有机物：氨基酸、核酸、蛋白质等主要内容离子交换原理固定相流动相应用例离子排斥色谱离子色谱一、离子交换原理离子交换通式阳离子交换R-SO3-H++M+R-SO3-M++H+阴离子交换R-NR3+Cl-+X-R-NR3+X-+Cl-离子交换通式一般形式：R-A+BR-B+A平衡常数（离子交换反应的选择系数）ssABABABK]][[][][/二、固定相离子交换剂基质材料：合成树脂（苯乙烯）、纤维素、硅胶带电基团：阳离子交换剂、阴离子交换剂–强阳离子交换剂SCX-SO3H–弱阳离子交换剂WCX-CO2H–强阴离子交换剂SAX-N+R3–弱阴离子交换剂WAX-NH2常用的离子交换剂多孔型离子交换树脂–粒径5-20m–交换容量高–柱效低薄膜型离子交换树脂表面多孔型离子交换树脂–柱效高–交换容量低离子交换键合固定相–机械强度高–柱效高理论交换容量：每克干树脂所含离子交换基团的量三、流动相一定pH值和盐浓度的缓冲溶液流动相强度和选择性(k,)–盐浓度（离子强度）–种类–pH(1)流动相中盐浓度的影响盐浓度增加，降低试样组分在固定相上的保留。(2)盐种类的影响阴离子交换：–洗脱强度：柠檬酸离子SO42-C2O42-I-NO3-CrO42-Br-SCN-Cl-HCOO-CH3COO-OH-F-阳离子交换：–洗脱强度：Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg2+Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+(3)pH的影响强离子交换剂：–pH影响弱电解质组分的离解。如有机酸和有机碱弱离子交换剂：–pH影响弱电解质组分的离解。如有机酸和有机碱–离子交换剂自身的交换容量四、应用例Separationofnecleotidesandrelatedcompoundsbyanionexchange五、离子排斥色谱离子排阻色谱离子排阻分配色谱（ionexclusionpartitionchromatography)离子节制分配色谱（ion-moderatedpartitionchromatography)离子排斥色谱的原理强阳离子交换树脂与有机酸的作用。由于Donnan电位的存在，使强酸阴离子受阻于树脂之外，而低电离度的弱酸分子可进入树脂内部，通过与树脂相互作用得到保留。选择性：–组分受阻程度的不同–组分与树脂功能基的极性相互作用的差异–组分与树脂基体间的非极性相互作用的差异有机酸的分离例六、离子色谱分离原理同离子交换色谱–采用低交换容量的固定相–低浓度的电解质溶液为流动相–检测技术的改进双柱离子色谱–