腺相关病毒包装操作手册

腺相关病毒（AAV）操作手册目录一、AAV安全注意事项二、AAV储存和稀释注意事项三、AAV介绍四、汉恒生物AAV产品服务及载体信息与现货列表五、AAV整体实验流程六、实验材料七、AAV载体构建八、AAV包装九、AAV收集和纯化十、AAV滴度测定十一、AAV感染细胞测试十二、AAV用于动物实验（重磅干货，五星推荐）十三、案例分享附录1附录2一、AAV安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)AAV相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。3)操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液浸泡后统一处理。4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。5)动物注射操作请在生物安全柜内（BL-2级别）完成。6)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。7)实验完毕用洗手液清洗双手。二、AAV储存和稀释注意事项1.AAV的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融病毒滴度会降低10%-50%），因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融。汉恒生物已对病毒进行了分装（200l/tube），收到后请直接放置-80℃保存即可。b．若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度。2.AAV的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用无菌PBS或生理盐水混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳)。三、AAV介绍腺相关病毒（AAV）属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的AAV，所以AAV被称作腺相关病毒。典型的AAV2基因组约4800bp，包括2个反向末端重复序列(ITR，145bp)和两个读码框(ORF)-Rep和Cap（图1）。ITR对合成互补DNA链是必需的；Rep和Cap可以翻译成多种不同蛋白，如AAV生活周期必需的Rep78、Rep68、Rep52和Rep40以及包膜蛋白VP1、VP2及VP3等。AAV病毒系统就是用目的基因替换掉Rep和Cap，然后与表达Rep和Cap基因的质粒共转，从而产生包含目的基因的AAV。目前AAV有12种血清型、100多种变体。不同的血清型对组织或器官有着不同的亲和性。由于安全性高、免疫原性小、表达周期久等优点，AAV被称为目前最适合在体研究（invivo）基因功能的利器。图1、AAV2基因组结构示意图。四、汉恒生物AAV产品服务及载体信息与现货列表1.汉恒AAV产品分类：常规基因的过表达和干扰定制（载体列表见“七、载体构建”部分）；组织特异性启动子过表达定制（载体列表见“七、载体构建”部分）；常规启动子和组织特异性启动子驱动的AAV-Cas9定制；AAV介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等（见表1）；双标、单标LC3自噬流监测工具（见表2）；组织特异性AAV-DIO载体的定制（原理见附件2）。2.汉恒AAV产品特点：安全-AAV不参与任何疾病的发生，已经用于临床疾病的治疗；高效-病毒滴度高达1013以上，组织感染能力超强；表达周期久-AAV免疫原性超低，基因持续表达半年以上；最全血清型-拥有全部12种血清型和一系列突变体亚型，几乎可以感染所有的组织和脏器；组织特异性-拥有DIO元件载体系统和最全的组织特异性启动子工具箱，如心脏、肝脏、肌肉以及各种神经元特异的启动子等；病毒产品全部经过无菌、无支原体、无内毒素检测，让实验安全放心。3.汉恒生物AAV主要载体及现货列表1)汉恒生物AAV主要载体列表（部分组织特异性启动子如心脏、肝脏、肌肉等没有在表中列出，欢迎咨询定制。）载体类型载体名称可插入片段大小启动子及其特点标记基因是否Cre依赖过表达pHBAAV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen1.6kbCMV，广谱，强ZsGreen否pHBAAV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen1.2kbCMV，广谱，强ZsGreen否pHBAAV-CAG-MCS-T2A-ZsGreen1.5kbCAG，广谱，强ZsGreen否pHBAAV-CAG-MCS-T2A-mcherry1.5kbCAG，广谱，强mcherry否pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-ZsGreen1.2kbCAG，广谱，强ZsGreen是pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-mCherry1.2kbCAG，广谱，强mcherry是pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-ZsGreen1.6kbhSyn，成熟神经元，中强度ZsGreen否pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-mCherry1.6kbhSyn，成熟神经元，中强度mcherry否pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-ZsGreen1.6kbCamkII，兴奋性经元神经特异启动子，强ZsGreen否pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-mCherry1.6kbCamkII，兴奋性经元神经特异启动子，强mcherry否pHBAAV-GFAP-T2A-EGFP1.6kbGFAP，星形胶质细胞，中强度EGFP否干扰pHBAAV-U6-MCS-CMV-ZsGreenshRNAU6ZsGreen否pHBAAV-U6-CMV-mCherryshRNAU6mcherry否circRNA过表达pHBAAV-CMV-crRNA-EF1-ZsGreen1.2kbCMV，广谱，强ZsGreen否在体敲除pHBAAV-gRNA-saCas9gRNAU6无否2)汉恒生物AAV光遗传学工具现货列表（表2）载体类型载体名称启动子及其特点标记基因是否Cre依赖抑制pHBAAV-CAG-DIO-eNpHR3.0-EYFPCAG（人巨细胞病毒启动子CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子），广谱，强EYFP是激活pHBAAV-CAG-DIO-hChR2(H134R)-mcherrymcherry是抑制pHBAAV-CAG-DIO-ArchT-EYFPEYFP是红光激活pHBAAV-CAG-DIO-C1V1(t/t)-TS-mcherrymcherry是抑制pHBAAV-CAG-DIO-Arch3.0-EYFPEYFP是激活pHBAAV-CAG-DIO-hCHETA-EYFPEYFP是抑制pHBAAV-CMV-DIO-eNpHR3.0-EYFPCMV（人巨细胞病毒启动子），广谱，强EYFP是激活pHBAAV-CMV-DIO-hChR2(H134R)-mcherrymcherry是抑制pHBAAV-CMV-DIO-ArchT-EYFPEYFP是红光激活pHBAAV-CMV-DIO-C1V1(t/t)-TS-mcherrymcherry是抑制pHBAAV-CMV-DIO-Arch3.0-EYFPEYFP是激活pHBAAV-CMV-DIO-hCHETA-EYFPEYFP是抑制pHBAAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFPhSyn（人源成熟神经元特异启动子），中强度EYFP否激活pHBAAV-hSyn-hChR2(H134R)-mcherrymcherry否抑制pHBAAV-hSyn-ArchT-EYFPEYFP否红光激活pHBAAV-hSyn-C1V1-(t/t)-TS-mcherrymcherry否抑制pHBAAV-hSyn-Arch3.0-EYFPEYFP否激活pHBAAV-hSyn-DIO-hCHETA-EYFPEYFP否抑制pHBAAV-GFAP-eNpHR3.0-EYFPGFAP（星形胶质细胞特异启动子），中强度EYFP否激活pHBAAV-GFAP-hChR2(H134R)-mcherrymcherry否抑制pHBAAV-GFAP-ArchT-EYFPEYFP否红光激活pHBAAV-GFAP-C1V1(t/t)-TS-mcherrymcherry否抑制pHBAAV-GFAP-Arch3.0-EYFPEYFP否激活pHBAAV-GFAP-hCHETA-EYFPEYFP否抑制pHBAAV-CaMKII-eNpHR3.0-EYFPCaMKII（兴奋性经元神经特异启动子），强EYFP否激活pHBAAV-CaMKII-hChR2(H134R)-mcherrymcherry否抑制pHBAAV-CaMKII-ArchT-EYFPEYFP否红光激活pHBAAV-CaMKII-C1V1(t/t)-TS-mcherrymcherry否抑制pHBAAV-CaMKII-Arch3.0-EYFPEYFP否激活pHBAAV-CaMKII-hCHETA-EYFPEYFP否3)汉恒生物AAV化学遗传学工具现货列表（表3）载体类型载体名称启动子及其特点标记基因是否Cre依赖白喉毒素介导的细胞毒性pHBAAV-CAG-DIO-DTR-2A-GFPCAG（CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子），广谱，强GFP是pHBAAV-hSyn-DTR-2A-GFPhSyn（人源成熟神经元特异启动子），中强度GFP否pHBAAV-CaMKII-DTR-2A-GFPCaMKII（兴奋性经元神经特异启动子），强GFP否Gq-DREADDpHBAAV-CAG-DIO-hM3D(Gq)-mCherryCAG（CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子），广谱，强mCherry是Gi-DREADDpHBAAV-CAG-DIO-hM4D(Gi)-mCherryCAG（CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子），广谱，强mCherry是Gq-DREADDpHBAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherryhSyn（人源成熟神经元特异启动子），中强度mCherry是Gi-DREADDpHBAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherryhSyn（人源成熟神经元特异启动子），中强度mCherry是Gq-DREADDpHBAAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherryhSyn（人源成熟神经元特异启动子），中强度mCherry否Gi-DREADDpHBAAV-hSyn-hM4D(Gi)-mCherryhSyn（人源成熟神经元特异启动子），中强度mCherry否Gq-DREADDpHBAAV-CaMKII-hM3D(Gq)-mCherryCaMKII（兴奋性经元神经特异启动子），强mCherry否Gi-DREADDpHBAAV-CaMKII-hM4D(Gi)-mCherryCaMKII（兴奋性经元神经特异启动子），强mCherry否4)汉恒生物AAV-mRFP-GFP-LC3自噬流监测工具（表4）载体类型载体名称启动子及其特点标记基因是否Cre依赖双标pHBAAV-mRFP-GFP-LC3CMV，广谱，强mRFP/GFP否单标pHBAAV-GFP-LC3CMV，广谱，强GFP否五、整体实验流程（图2）图2、AAV包装实验流程图。六、实验材料AAV系统包括目的基因表达质粒（过表达、干扰等）pHBAAV-xxx（表1~4）、包装载体pAAV-RC和pHelper。1.pHBAAV-xxx载体信息请参考表1~4，主要载体图谱请参考附件1。2.菌株：大肠杆菌菌株Stbl3。用于扩增pHBAAV-xxx及其包装质粒。3.细胞株：AAV-293，AAV病毒的包装细胞，生长培养基为DMEM+10%FBS+双抗（完全培养基）。为了保证实验的稳定性和持续性，在AAV-293细胞对数生长期尽量多冻存一些细胞作为备份，增加细胞复苏成活率。注：为了达到最好的细胞培养状态，推荐使用汉恒生物推出的SaveItTM抗支原体试剂（货号：HB-SV-1/2/3/5/10）。七、AAV载体构建AAV包装之前需要构建表达目的基因的载体pHBAAV-xxx。汉恒