中药显微鉴定

显微鉴定方法内容提要显微鉴定的简介显微制片方法的分类显微制片方法植物显微鉴定的简介(MicroscopicalIdentification)植物显微鉴定是植物鉴定的重要手段之一。它通过植物组织、细胞、细胞后含物等特征进行微观分析，达到鉴别真、伪、优、劣的目的。植物显微鉴别不但适用于中药材（饮片），也适用于中成药制品。这一检测方法先后被《中国药典》、《香港中药材标准》、《日本药局方》、《印度草药典》、《美国药典》等采用。《中国药典》附录Ⅱ显微鉴别法显微鉴别法系指用显微镜对药材（饮片）切片、粉末、解离组织或表面制片及含药材粉末的制剂中药材的组织、细胞或内含物等特征进行鉴别的一种方法。鉴别时选择具有代表性的供试品，根据各种鉴别项的规定制片。制剂根据不同剂型适当处理后制片。显微鉴别方法分类1根据不同剂型适当处理后制片，分为：药材（饮片）显微制片：横切片或纵切片制片、粉末制片、表面制片、解离组织制片、花粉粒与孢子制片、磨片制片。含饮片粉末的制剂显微制片：按粉末制片法制片细胞壁性质鉴别：木质化细胞壁、木栓化或角质化细胞壁、纤维素细胞壁。细胞内含物性质鉴别：淀粉粒、菊糖、草酸钙结晶2根据切片方法，分为：徒手切片、冷冻切片、半薄切片（0.5-2.0微米）、超薄切片（50-70nm)。永久制片（以石蜡切片为例）石蜡切片石蜡制片法借助于石蜡的特性，以其作为填充剂和包埋剂，用石蜡切片机进行切片的制作方法。石蜡制片是目前植物性中药重要的、常用的、效果较好的切片方法之一，但制片周期较长是其缺点。石蜡制片的步骤及操作基本过程如下：取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡及包埋→切片→粘片→脱蜡→染色→透明→封片。1材料的选择选材（取样）：根据鉴定要求，选择有代表性的部位；根、根茎、藤茎等类圆形的材料要包含有中心部位，至少为1/4以上；叶、花萼、花冠等材料要包含主脉部位。材料切成长3cm、直径1cm左右块或段，待切面应削平。样品的量一般不得少于实验所需用的3倍，即1/3供实验分析用，另1/3供复核用，其余1/3则为留样保存，保存期至少一年。2材料的预处理处理：清洗水洗，用柔软的毛刷轻轻的刷洗表面。杀生固定保存将需要制片材料迅速杀死，使组织保持原生活状态，一般以渗透力较强的的药剂作杀生剂较好。固定液⑴FAA固定液38%甲醛：冰醋酸：70%乙醇5：5:95用于根、茎、叶、花药、子房的固定，固定时间24h⑵FPA固定液38%甲醛：丙酸：70%乙醇5：5:95⑶卡诺氏固定液乙醇：冰醋酸3:1用于根尖、花药、子房的固定，固定不超过时间24h材料处理时，注意不能影响要观察的显微鉴别特征。如要观察菊糖、粘液等在软化、切片、装片等过程中，均不可与水接触，以免溶解消失；要观察挥发油、树脂等，则不可与高浓度乙醇或其它有机溶媒接触。3脱水脱水常用乙醇、二氧六环、正丁醇、叔丁醇、丙酮等目的除去组织中的水分，使细胞变硬；便于包埋物进入组织及细胞，便于切片；脱水后的组织再经过透明，便于观察。方法由30%、50%、70%、85%、95%、100%、100%各级酒精处理2-4h。4透明透明常用二甲苯、氯仿、苯、甲苯等目的便于包埋剂(石蜡）及封藏剂（加拿大树胶）的互相融合方法用1/4二甲苯、1/3二甲苯、1/2二甲苯、二甲苯、二甲苯各处理3-4h。4透蜡、包埋透蜡常用固体石蜡目的石蜡进入细胞组织内，便于切片透蜡方法50%、75%、100%石蜡各处理3h。温度：63-64℃包埋材料在石蜡中央，便于修蜡和切片5蜡块的分割、切片蜡块的分割将蜡块修成适合的大小，蜡边与材料尽量平行。上宽下窄，分割好的材料要妥善保管。切片将蜡块粘在切片机上，调整刀的角度（与蜡块保持15°的倾角），厚度调整为20微米以内。注意：①切片时速度要快，不可来回拉锯式切割；②切片时右手不动，只是右臂移动，动作用臂力而不用腕力。机器切片石蜡切片机滑走切片机选片选择薄而完整的切片置载玻片上，加水1滴于玻片上，在展片台上展片，置低倍镜下观察，选取组织构造完整、显微特征清晰者备用。粘片用蛋清与甘油（1:1）。顺时针用力搅拌均匀，搅拌至无泡沫产生为止。粘片时，滴少许粘片剂，用手指涂抹均匀。6选片、粘片染色方法复染和单染；滴染和泡染。染料的分类天然和人工染料；碱性、中性和酸性染料；核燃料、细胞质染料、细胞壁染料、组织化学染料、活体染料等。常用染料苏木精、碱性品红、番红和固绿；封片用加拿大树胶封片、目的便于长期保存；由于加拿大树胶折射率高适合在显微镜下观察。7染色、透明及封片透明梯度二甲苯目的便于观察冷冻切片仪器：冷冻切片机包埋材料：水、胶水切片温度：-20℃优点：节省时间、方便快捷。注意事项：包埋时，不能有气泡，否则会有空洞。一定要将材料放直立胶水的中央，使材料完全被胶水包裹。并且外围胶水的厚度要大于等于材料的半径，有利于粘片。不宜将材料和胶水冻的太硬，否则在切片过程中会造成中间材料的破损。切片时，切片卷起形成圆筒，是刀刃太钝并附有杂物、刀得倾角太大、切片太厚等原因引起的。切片有横纹及薄厚不均一，是刀夹松紧不均一、刀的倾角过大引起的。切片有纵裂或纵条纹，是因为刀口有缺口，组织太硬引起的。冷冻切片机粉末制片1药材粉碎选取完整的药材或待鉴定部位，粉碎，过《中国药典》4号筛备用。斯氏液装片斯氏液由醋酸∶甘油∶水（1∶1∶1）组成，主要用于观察淀粉粒及一些遇水合氯醛试液易溶解的成分。如多糖类成分、树脂类成分等。水合氯醛液装片水合氯醛试液能渗透组织，使皱缩的细胞膨胀；并能溶解淀粉粒、蛋白质、树脂、挥发油和叶绿素等，使细胞组织变得透明而清晰。3.4粉末特殊处理制片方法含多量淀粉的药材粉末大量淀粉粒的存在会影响观察、描绘及摄影等效果。取一部分粉末于试管中加水煮沸，使淀粉粒糊化而溶解，放置或用离心机使所需细胞、组织下沉管底，用长吸管将沉淀物吸出供制片观察。3粉末特殊处理制片方法含多量油类的药材粉末进行脱脂以除去大部分油脂，取少许粉末于小烧杯中，加氯仿少许搅拌浸渍，过滤，在滤纸上再加少许氯仿洗涤粉末即可。也可直接将粉末置载玻片进行。含纤维较多的粉末细胞彼此不分离，则可以用5%氢氧化钾溶液浸渍若干小时或在水浴上加热浸渍，使组织分解后再行制片观察。颜色很深的药材粉末进行脱色处理，取粉末少许置小烧杯中或载玻片上，加少许3%的过氧化氢溶液（双氧水）浸渍数分钟，待粉末颜色变浅时，除去多余液体，加新煮沸的冷蒸馏水，以除去粉末中的大量气泡即可，然后再行制片观察。水泛丸：全球面取样，将丸药从中心剖开，从1/2球面上刮取。大蜜丸：将丸药从中心剖开，从1/2或1/4球面上刮取；也可从内部挑取适量粉末。4中成药粉末制片散剂、颗粒剂、胶囊：挑取部分粉末；包衣丸、片：剥除糖衣或包衣，取适量丸或片心磨碎后，取粉末装片。5粉末半永久制片或永久制片永久制片制备粉末永久片需将粉末置离心管中，加50%～70%的乙醇使完全浸没，用细玻棒搅拌5～10分钟后离心，倾去乙醇液；再加95%乙醇搅拌离心，倾去乙醇液；再加无水乙醇2次，倾去乙醇液后加丙酮1次，然后用丙酮与二甲苯的等量混合液处理，每次1～2分钟。最后加入二甲苯使材料透明，搅拌均匀后用滴管吸取少量混合液至载玻片上，滴加1滴中性树胶液，盖上盖玻片即可。半永久制片粉末加少量稀甘油充分湿润后，吸除多余的甘油，并将载玻片在酒精灯上微微加热，用玻棒挑适量甘油明胶，盖上盖玻片，并轻轻加压，以免胶层太厚影响观察，待冷却后用刀片刮去盖玻片四周溢出的明胶。经水合氯醛处理的制片，需将水合氯醛液尽量除尽，加甘油，再除去甘油，同上加甘油明胶封藏即可。谢谢大家！