08生物技术制药 第三章

项目二基因工程制药技术生物技术制药模块一必备知识一、掌握基因工程相关概念二、了解基因工程发展史模块一必备知识基因（gene）：染色体上含有特定遗传信息的一段脱氧核苷酸序列，是遗传的最小功能单位。模块一必备知识基因具体是什么？⑴基因是实体，它的物质基础是DNA（或RNA）。⑵基因是具有一定遗传效应DNA分子中特定核苷酸序列。⑶基因是遗传信息传递和性状分化发育的依据。⑷基因是可以分的，根据基因的产物，基因可以分为①编码蛋白质的基因转录为mRNA②转录成为RNA以后不再翻译成为蛋白质，tRNA，rRNA③不转录的却有特定功能DNA区段，如启动子、操纵基因等模块一必备知识DNA：四种脱氧核糖核苷酸AGCT组成；RNA：是由四种核糖核苷酸AGCU组成；DNA是遗传信息的储存者，蕴藏于DNA的遗传信息传递到RNA分子，然后再传给蛋白质，蛋白质是遗传信息的体现者，这就是遗传信息流向的中心法则，也是基因表达的基本步骤。中心法则：DNA→mRNA→蛋白质真核细胞的翻译过程模块一必备知识基因工程（GeneticEngineering）：将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼界重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。1、供体:目的基因（TargetGene）：即有用基因，可用于表达产生某种药用蛋白。2、载体：（Vector）：能将外源目的基因携带到宿主细胞，并能在宿主细胞中进行自我复制的DNA分子。3、受体：基因工程细胞（Geneticallyengineeredcell）：携带了外源目的基因和载体，即重组DNA分子的宿主。也叫做DNA重组技术（DNARecombination）、基因无性繁殖、分子克隆（MolecularCloning）。模块一必备知识实现基因工程的四个条件：①基因②工具酶③载体④受体细胞模块一必备知识上游：获得目的基因组建重组质粒构建工程菌（细胞）下游：培养工程菌产物分离纯化产品质量控制分切接转筛增检模块一必备知识基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。模块一必备知识限制酶(Restrictionenzymes)即限制性核酸内切酶的简称，是一类专一性很强的核酸内切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。模块一必备知识限制酶的种类：Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2+。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。模块一必备知识限制酶的命名1973年由Smith和Nathaus提出。是以寄主微生物属名大第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）写成斜字体的3个字母缩写，菌株名以非斜体符号加在这三个字母的后面。若同一菌株中有几种不同的限制酶时，则以罗马数字加以区分。例如：HindⅢ表示是从Haemophilusinfluenzae(流感噬血杆菌)菌株d中分离出来的第三种限制酶。模块一必备知识限制酶的特性1、专一识别不同的特异核苷酸序列2、识别序列具有回文结构回文结构：如果都从5'末端向3'末端读其碱基顺序，则在识别序列的两条核苷酸链中的碱基排列次序是完全相同的，这种结构称为回文结构（Palindromicstructure）。3、各种限制酶的切割类型粘性末端（stickyends）：限制酶错位切断DNA双链而形成的彼此互补的单链末端。平整末端（bluntends）：限制酶在同一位点平齐切断DNA两条链而形成的双链末端。模块一必备知识模块一必备知识DNA聚合酶(DNApolymerase)能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(全酶)；大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)模块一必备知识DNA连接酶（DNAligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。1.T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。2.大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。模块一必备知识基因工程中常用的其他酶1.末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶）2.T4噬菌体多核苷酸酶3.核酸酶（Nuclease）4.碱性磷酸酯酶模块一必备知识载体：能在细胞内进行自我复制的DNA分子就是外源DNA片段（基因）运载体（Vector）,又可称为分子载体或无性繁殖载体。常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、λ噬菌体、病毒载体人工染色体功能：为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。为目的基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。理想载体的基本条件：合适的复制位点多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源DNA稳定、高拷贝模块一必备知识质粒（Plasmid）是一些存在于微生物细胞内染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。常用的几种质粒载体pBR322pUC系列载体模块一必备知识多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体模块一必备知识二、基因工程的发展史三大发现：1、肺炎球菌转化证明DNA遗传物质2、双螺旋结构和半保留机制确定DNA结构3、密码子遗传信息传递方式中心法则肺炎球菌转化A：S有夹膜致病菌，B：R突变非致病菌，C：加热杀死S菌，D：活R死S模块一必备知识三大发明：1、酶的发现（限制内切酶、连接酶）2、载体的出现3、逆转录酶的发现