医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序

医院人感染医院人感染H7N9H7N9禽流感病毒核酸检测禽流感病毒核酸检测标准操作程序标准操作程序陈瑜传染病诊治国家重点实验室浙江大学附一院检验中心2013.05.232013.05.23确保人感染H7N9禽流感病毒核酸检测过程标准化、规范化，避免因不规范操作对检测结果造成的影响，保证结果的准确性和可重复性目的医疗机构临床基因扩增实验室按照《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔2013〕383号）和《关于做好医疗机构人感染H7N9禽流感检测试剂供给保障工作的通知》（卫发明电〔2013〕29号）有关要求，开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作。适用范围尽量采集患者发病早期的呼吸道样本：上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液；下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等尽量在抗病毒药物使用前采集可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率患者有下呼吸道样本时，应优先采集样本种类已发现H7N9病毒在痰和下呼吸道灌洗液阳性率高，持续时间长鼻咽拭子病毒检测阳性率低，持续时间短痰液标本中病毒能持续到治疗后第6天，而咽拭子标本并不能检测到样本种类采集物品包采集前的准备常用的采样液/病毒运输液(VTM）采集前的准备1.pH7.4～7.6的Hanks液2.MEM/DMEM液若标本需要病毒培养，需在采样液中加入抗菌素，可用青霉素（终浓度100U/ml）、庆大霉素（终浓度1mg/ml）和抗真菌药物（两性霉素B，终浓度2µg/ml）。在无菌的带螺旋塑料管分装2-3ml采样液。最好储存在:–20℃；4℃可放48–96h，室温1–2天。采样拭子：使用头部为聚酯纤维的病毒采样拭子（鼻咽型），铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄1.咽拭子样本采集用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖，贴上标签。√×2.鼻拭子将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖，贴上标签。样本采集住院病人标本采集实例门诊病人标本采集实例人感染H7N9禽流感病毒实验室活动、样本采集和运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理样本包装和运输样本采用密封容器包装，立即送往实验室，运输时在包装箱内填充吸水材料，运输过程中保持样本采集管直立状态，不能倾斜。若气温高时，需放入冰块降温。样本抵达实验室后，应尽快进行检测，24小时内能检测的样本可置于2～8℃暂时保存，24小时内无法检测的样本则应置于≤-70℃状态保存。如无-70℃保存条件时，可于-20℃冰箱暂存。样本避免反复冻融。样本包装和运输样本包装和运输专用标本运送箱荧光基团荧光检测元件根据荧光PCR技术原理，针对H7N9禽流感病毒的M基因、H7基因和N9基因保守区设计特异性引物和Taqman探针，通过荧光PCR检测仪进行检测，从而实现对H7N9亚型禽流感病毒RNA的定性检测。PCR检测原理M‐forward(GAGTGGCTAAAGACAAGACCAATC),M‐reverse(TTGGACAAAGCGTCTACGC), M‐probe: (FAM‐TCACCGTGCCCAGTGAGCGAG‐BHQ1);H7‐forward(AGAGTCATTRCARAATAGAATACAGAT), H7‐reverse (CACYGCATGTTTCCATTCTT)H7‐probe: (FAM‐AAACATGATGCCCCGAAGCTAAAC‐BHQ1);N9‐forward(GTTCTATGCTCTCAGCCAAGG), N9‐reverse(CTTGACCACCCAATGCATTC) N9‐probe: (HEX‐TAAGCTRGCCACTATCATCACCRCC‐BHQ1).引物和探针鼻/咽拭子标本应在保存液中充分搅动（至少40下），以洗脱拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后在4℃，10000rpm离心20分钟，上清液用于提取RNA。PCR检测--样本处理核酸提取应当在样本处理区进行取适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。病毒RNA提取可采用Trizol法、硅胶膜吸附法、磁珠法等，按相应说明书要求进行操作。提取好的RNA应及时用于检测，否则应当-70℃保存。如无-70℃保存条件，可于-20℃冰箱暂存。PCR检测--样本处理试剂准备应当在试剂准备区进行。根据所用的试剂盒，样本可进行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亚型或H7N9病毒核酸的检测。试剂的配制按所用试剂盒说明书进行。PCR检测--试剂准备、反应体系分管PCR扩增检测在扩增区进行。待检PCR管转移至扩增区，按顺序置于PCR仪上，编辑样本信息，按试剂和仪器说明书设定循环参数。ABIPrism7500、ABIPrism7000、RG3000、LightCycler型等全自动荧光PCR检测仪。PCR检测--扩增检测根据所用试剂盒说明书设置基线值（baseline）。荧光阈值（threshold）设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点为原则，且Ct值应大于所设置的扩增循环数（或显示为undet）。使用仪器配套软件自动分析结果。PCR检测--结果分析阳性弱阳性按照试剂盒说明书判断：结果报告反应液模式1模式2模式3甲型通用M++-H7+--N9+--结果报告H7N9禽流感病毒核酸检测阳性甲型流感病毒核酸检测阳性，H7N9禽流感病毒核酸检测阴性甲型流感病毒核酸检测阴性，H7N9禽流感病毒核酸检测阴性1.样本采集、处理、运输及保存不当时，可因病毒RNA降解出现假阴性结果，也可因为样本“污染”出现假阳性结果。2.检测过程应对可能出现的假阳性和假阴性进行质量控制，除了检测试剂盒所提供阳性和阴性对照外，每次临床样本检测时，至少应当有1份弱阳性和3份阴性质控样本（多份阴性质控样本设置对实验室“污染”所致假阳性的监控更为有效），随机放在所检测样本的中间。质量控制3.弱阳性质控样本可为检测阳性的灭活稀释后保存的临床样本、灭活病毒或假病毒颗粒等；如所采用的试剂盒有“内标”控制假阴性，或弱阳性质控样本来源困难，可暂不设弱阳性质控。4.阴性质控样本采用标本采集管内溶液即可。5.质控样本应与临床标本同等对待，参与样本核酸提取和扩增检测全过程。质量控制6.样本结果在灰区或者甲型通用引物阴性，而H7和/或N9特异性引物出现阳性的结果，应严格遵照操作程序进行重复实验，并注意与可能的实验室轻度或样本交叉“污染”所致假阳性结果区别。必要时重新采集样本检测。7.试剂盒中的阳性和阴性对照用于判断实验室结果的有效性，按试剂盒说明书进行。例如：某试剂盒规定，在30个循环之前，阳性质控品应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应重复实验。质量控制1.人感染H7N9禽流感病毒实验室活动、样本采集和运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。从事人感染禽流感检测的技术人员必须经过生物安全培训并具备相应的实验技能，在检测过程中必须采取生物安全防护措施（使用眼罩、N95型口罩等）。注意事项2.样本核酸提取必须在Ⅱ级生物安全实验室，经过年检合格的二级生物安全柜内进行。实验室应具有良好的通风。注意事项3.标本应尽可能新鲜，核酸提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA降解。提取过程如涉及离心步骤，应采用低温冷冻离心机；在生物安全柜内提取、加样过程中，为防止RNA降解，可将试管架置于碎冰或冰盒上。注意事项冰盒4.试剂的配制除酶混合物外，其它试剂在使用前应当在室温充分复融，混匀并瞬时低速离心。反应液分装时尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免管内溶液泄漏污染仪器。分装有扩增反应液的反应管应当扣盖或装入密封袋内再转移至样本处理区。5.加样时应当使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。注意事项6.扩增完毕取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。7.实验应严格分区操作，各区物品、工作服等均应当专区专用，不得交叉使用。8.每批实验室后，可采取实验室通风、10%次氯酸钠溶液或75%酒精擦洗地/台面、紫外照射等措施，消除可能存在的扩增产物气溶胶污染。注意事项9.实时荧光PCR仪器使用前最好预热30分钟，连续进行实验时，最好间隔1h以上再进行下一批检测。10.注意仪器设备的日常和定期维护，加样器、扩增仪和温育设备应进行定期校准。试剂盒及一次性使用的无DNA酶和无RNA酶的PCR反应管、离心管、带滤芯吸头等应进行每批质检。注意事项Thanks!Thanks!谢谢！谢谢！