a-淀粉酶高产菌株筛选实验

1a-淀粉酶高产菌株的分离鉴定及固定化枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，是a-淀粉酶高产菌株之一，其菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，在遗传学研究中应用广泛。其芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。广泛生长在中性的的含淀粉多的环境中，如富含淀粉的面粉厂、土壤等。淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α-淀粉酶为内切酶，以无规则的方式切开淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，而使淀粉生成糊精和低聚糖，是一种钙离子依赖性酶。β-淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖，为外切酶。葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1，4糖苷键的外切酶，从非还原糖末端切下葡萄糖分子。a-淀粉酶是一种胞外酶，由于酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题，其中α-淀粉酶的固定化交联法是目前比较理想的方法。另可尝试探索用一定浓度的凝胶包埋枯草芽孢菌或用吸附法、交联法将枯草芽孢杆菌固定化，使菌体不能流动而酶可以存在反应液里。凝胶柱底部可选用一定大小的半透膜使酶和淀粉不能流出反应凝胶柱，而产物可以流出。【实验一】一、a-淀粉酶生产菌种的分离与培养、筛选二、【实验原理】大多数枯草芽孢杆菌好氧，最适生长温度为32℃,PH为7.2，转速为140r/min，接种量为9％，芽孢率生长最适温度36℃，最适PH为7.2，最适转速120r/min。在以淀粉为碳源的固体培养基上用划线法分离纯化出产a-淀粉酶的菌株，根据是否可产生透明圈来筛选。透明圈越大，产酶能力越强。三、【实验仪器和材料】1、试剂：0.1%吕氏(Loeffier)美蓝染液配制方法：A液：美蓝(methyleneblue,又名甲烯蓝)0.3g,95%乙醇30ml；B液：0.0l%KOHl00ml。混合A液和B液即成，根据需要可配制成稀释美蓝液。2、淀粉酶筛选富集培养液（细菌）淀粉10g、硫酸铵10g、氯化钠5g、硫酸亚铁0.5g、磷酸氢二钾1g、牛肉膏1g，定容1L，调至pH为7，取300ml分装9ml于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115℃，20min。3、淀粉酶筛选培养基I（细菌）淀粉3g、硫酸铵3g、氯化钠1.5g，用无机酸碱调pH值至7.0左右，加蒸馏水定容至300ml，再加琼脂5.4g，装入三角瓶，塞上棉塞，用报纸包扎瓶口。高压蒸汽灭菌，于115℃，20min，冷却至50-55℃左右时倒入无菌平皿。4、淀粉酶筛选培养基II（细菌）淀粉10g、硫酸铵10g、氯化钠5g、硫酸亚铁0.5g、磷酸氢二钾1g、牛肉膏1g，定容1L，调至pH为7，再加18g琼脂，取300ml分装9ml于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115℃，20min。5、器材烧杯、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、瓷缸、接种环、刮铲、载玻片、显微镜、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片2四、【实验步骤】1、富集培养（第1天）：取标本于90ml无菌水，放置于摇床150rpm，摇晃5min，取出后稍静置。用无菌枪头吸取上清液1ml接入9ml的富集培养液中，同时做一个不接菌液的空白对照管一起培养。置30℃培养箱中培养20-24小时（第2，3天）。2、观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察菌的形态和出芽生殖情况。活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。（第2天）水一碘液浸片的观察：在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌液放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片。3、镜检：取少许富集的菌液观察菌的形态。（第2天）4、菌液稀释：用无菌枪头吸取0.5ml富集菌液，加入装有4.5ml无菌水的试管中，吹吸几次，让菌液混合均匀，稀释成10-1稀释液。再用1ml无菌枪头，吸取10-1稀释液0.5ml，移入装有4.5ml无菌水的试管中，吹吸混匀，即成10-2稀释液。同样做法再一次，做成10-3稀释液。5、倒平板培养（第2天）：倒筛选培养基I平板，凝固待用。用无菌枪头分别吸取10-2、10-3浓度的稀释液0.1ml于平板上，用涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀。平放桌面30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，置30~32℃再培养24h或稍长(过长则霉菌长出)（第3，4天）。6、纯化：从长有单菌落的平板中选取典型的大的透明圈菌落，用接种环挑取一环的菌，在筛选培养基I平板中采用划线分离法分离菌。并同时制片做纯度检查。若不纯，应进一步挑取该菌落采用划线分离，直至获得纯培养体为止。涂片镜检，菌落观察。（第4，5天）7、菌种保藏：将分离的酵母菌转接于筛选斜面培养基上培养（从第6步中的每个平板保藏8~10株），待长好后置于冰箱内4℃下保存。（第4，5天）8、将保藏的菌株接种到筛选培养基II平板中，每个板接8～10株，培养1-2天后，选择4-5株高产菌株保藏备份并分别进行摇瓶培养，进行酶活测定。五、酶活测定方法（1）DNS法筛选出高酶活菌株。标本本实验设定40℃时在5min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位（U）。计算酶活力的公式为:酶活力单位=C酶×V酶×n。式中C酶为酶液中麦芽糖的浓度；V酶为提取酶液的总体积；n为酶液的稀释倍数。利用麦芽糖梯度标准液绘制标准曲线，用SPSS12.0统计软件包计算回归方程，求出相关系数和标准误注：DNS法测还原糖-DNS-二硝基水杨酸DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中。3DNS法测还原糖-DNS试剂的制备将6.3克DNS和262ml2mol/L氢氧化钠，加到500ml含有182克酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000ml，即制成3,5-二硝基水杨酸试剂，贮于棕色瓶中备用。DNS法测还原糖-葡萄糖标准曲线的绘制分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25ml试管中，分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15ml刻度。在540nm波长下测定吸光度。DNS法测还原糖-样品的测定样品液适当稀释，使糖浓度为0.1-1.0mg/ml，取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数。求出样品中糖含量。六、【注意事项】1、美兰染色浓度和时间严格掌握；2、平板培养时间不宜过长，过长则霉菌长出。【实验二】二、菌株的鉴定一、【实验目的】学习酵母菌的鉴定方法，熟悉使用分子生物学手段进行微生物鉴定。二、【实验原理】微生物鉴定是科研及生产过程中非常重要的工作。可以通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行鉴定。三、【实验仪器和材料】A、DNA提取需要配置的试剂高盐的TEbuffer终浓度配制50ml10mMTris.Cl,pH8.00.5ml(1M母液)0.1mMEDTA,pH8.00.01ml(0.5M母液)1MNaCl1.8g室温可保存几年CTAB提取液4终浓度配制200ml2%(W/V)CTAB4g100mMTris.Cl,pH8.020ml(1M母液)20mMEDTA,pH8.08ml(0.5M母液)1.4MNaCl10.22g室温可保存几年10×CTAB/NaCl溶液(10%CTAB/0.7MNaCl)在80mlH2O中溶解4.1gNaCl，缓慢加入10gCTAB，同时加热并搅拌。如果需要，可加热至65℃溶解。定容至100ml。其它化学试剂：异丙醇、乙醇、液氮、Taq酶、dNTPs、引物。B、仪器移液枪（10、100、1000μl）,0.2mlPCR管，枪头，2mleppendorf管，饭盒。四、【实验步骤】1.形态学鉴定：（第7天）A．菌落形态观察按普通微生物实验指导书观察所分离的细菌菌落特征。B.细胞形态学观察按普通微生物实验指导书简单制片法观察，先低倍镜，后高倍镜观察并绘制细胞形态图。2.分子生物学鉴定：（1）菌体DNA的提取（CTAB法提取真菌基因组DNA）（第7,8天）1)取少量酵母菌落连同部分培养基一起放入研钵中，加入液氮粉碎，然后加入800μl2%65℃保温的2×CTAB抽提液，混匀，65℃保温30～60min。2)加入800μl的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，10000r/min，离心5min。3)取上清(约600μl)，加入1/10体积（约60μl）的65℃的CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀。4)用等体积(约600μl)的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，10000r/min，离心5min。5)取上清(约450μl)，加入0.8V的异丙醇沉淀核酸，颠倒混匀，（如沉淀可见，继续做下步，否则，-20℃保温10~20min）。6)4℃，12000r/min，离心10min。7)去上清，用高盐的TEbuffer重悬（约100μl）。（可65℃保温30min，至大部分溶解）。8)加入0.8体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀（如没有沉淀，-20℃保温10~20min），4℃，12000r/min，离心15min。9)去上清，70%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TEbuffer重悬（30~60μl）。（2）DNA质量检测（第7,8天）以1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA大小及提取质量；紫外分光光度计法检测DNA纯度（将DNA稀释50倍后分别测OD260和OD280，并计算OD260/OD280的比值）。DNA浓度计算：5（3）PCR扩增（第9天）核糖体DNA普遍存在于生物中,真核生物的核糖体RNA中包括26S、18S、5.8S和5S4种不同沉降系数的核糖体RNA片段,它们分别对应的基因片段既具有遗传上的相对稳定性,同时由于各种原因具有一定的突变,使它们作为一种良好的生物分类鉴定材料得到广泛的重视。早期一般选取大小适中的18S序列作为鉴定的标准,随后26S的D1/D2区序列和ITS序列也被用于应用于鉴定工作中(图1)。本实验使用ITS序列进行鉴定，包括ITS1和ITS2两个转录间隔区。PCR反应引物使用ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。图1真核生物钟编码核糖体的序列（5'-3'）取一PCR管，按下述PCR体系加入PCR扩增所需的试剂：ddH2O10×PCRbuffer（withoutMgCl2）MgCl2(25mM)dNTP(10mM)5’primer(10mM)3’primer(10mM)Template（50-500ng/μl）TaqDNApolymerase(5U/μl)34.6μl5μl4μl1μl2μl2μl1μl0.4μlTotal50μl将上述加样后的PCR管放到小离心机低速甩一下，放入PCR扩增仪进行扩增。扩增反应程序按如下设定：94℃预变性5min94℃变性30sec52℃退火30sec40个循环72℃延伸60sec72℃延伸5min4℃保温（到达此温度时停止PCR扩增，将PCR管取出）（4）PCR扩增检测以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增是否有所想要的大小的目标条带，大概浓度如何。（5）测序将符合要求的样品