如何正确的设计从生物样品中分离纯化生物大分子

10级临床七年二班第五组背景介绍：生物大分子生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。实际上生物大分子的特点在于其表现出的各种生物活性和在生物新陈代谢中的作用。生物大分子大多数是由简单的组成结构聚合而成的，例如蛋白质的组成单位是氨基酸，核酸的组成单位是核苷酸等。蛋白质、核酸和多糖是3类主要的生物大分子，它们在分子结构和生理功能上差别很大，然而，在以下几个方面又显出共性：在活细胞内，生物大分子和相应的生物小分子之间的互变，通常通过脱水缩合，或加水分解。蛋白质链（或称肽链）、核酸链和糖链都有方向性，尽管方向性的体现各不相同。蛋白质、核酸和多糖分子都有各具特征的高级结构，正确的高级结构是生物大分子执行其生物功能的必要前提。在活细胞中，生物大分子互相密切配合，共同参与生命过程，甚至很多情况下形成生命活动必不可少的复合大分子，如核蛋白、糖蛋白。通用的技术路线设计方案1.确定要分离提纯的生物大分子的目的和要求不论是学生学习简单的分离提纯方法，还是科研人员进行研究、开发或者探索新物质，一个明确的目的和要求都是必不可少的。本课题要求对生物大分子进行分离提纯，也即在了解生物大分子（即蛋白质、核酸、脂质、糖类）的前提下，进行尽可能完善的提纯，同时也应注意满足现实设备情况。2.建立相应可靠的分析测定方法分离提纯最为重要的就是最终的“纯度”，所以一套完善可靠地分析测定方法就是进行工作的前提条件。没有这双“眼睛”，将无法得到最终的实验结果。3.查阅文献调研和预备性实验要进行分离提纯就必须掌握四种生物大分子的一般理化性质以及需要提纯的产物的一些特殊理化性质，只有这样才能进行分离提纯的工作。4.生物材料的破碎和处理需要分离的生物大分子往往贮存在生物体内，而根据生物种类的不同，如微生物、动物、植物等，有不同的生物材料处理方式，而处理方式的得当与否，往往也决定着最终的提取率的高低甚至实验的可行性。5.分离纯化方案的选择和探索同样的一类物质往往有很多种方案可以进行分离提纯，但如何根据所需生物大分子的种类、它所处的生物环境、客观因素等种种条件来选择最好的一种分离纯化方式，是整个实验最为困难的步骤。而在一些尖端领域，甚至需要研究人员自行探索新的方案，这无疑又大大加大了这一步的难度。所以可以说，这一步是整个实验过程中最为困难的一步，也应是投入精力最多、选择最仔细的一步。6.生物大分子纯度的检测根据提纯的生物大分子种类不同，选用相应的检测方式进行检测。7.产物的浓缩、干燥与保存常用的检测方法物理、化学方法：比色法、气相/液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。但应注意，如果实验对精确性要求较高则必须同时采用2-3种不同的纯度鉴定法才能确定。生物学的测定法：酶活测定、蛋白质含量测定、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；实验需要了解的理化性质在水和各种有机溶剂中的溶解性。在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。固态时和冻干时的稳定性。物理性质：分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。化学性质：对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。对其他生物分子的特殊亲和力等。各种生物大分子进行分离提纯的技术路线要点1.核酸的分离纯化①分离纯化原则：保持核酸分子一级结构的完整性意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。具体原则：温度不要过高；控制pH值范围(pH值5-9);保持一定离子强度;减少物理因素对核酸的机械剪切力。防止核酸生物降解DNA酶抑制剂：金属离子螯合剂；阴离子型表面活性剂RNA酶抑制剂：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸盐)；肝素；复合硅酸盐；RNase阻抑蛋白；氧钒核糖核苷复合物②分离纯化的步骤：取材：核酸在细胞内部，所以需要破碎细胞才能取得核酸，常用方法如下：高速组织捣碎机捣碎；玻璃匀浆器匀浆；超声波处理法；液氮研磨法；化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）；生化法（溶菌酶、纤维素酶等）除杂：肝糖元、淀粉及粘多糖：取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死；加入淀粉酶；在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液；以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA。蛋白质的除去：加入去污剂如SDS；氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提；苯酚水溶液抽提；加入浓盐溶液如NaCl。不同类型核酸的分离：（1）从DNA中除去RNA：核糖核酸酸酶选择地破坏RNA；钙盐分步沉淀；活性炭吸附。（2）从RNA中除去DNA：苯酚水溶液抽提；加入脱氧核糖核酸酶处理。同类核酸的分离：（1）RNA混合物的分离：多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。（2）DNA混合物的分离：常用磷酸钙、ECTEOLA-纤维素、DEAE-纤维素和甲基化白蛋白柱层析，逆流分溶，梯度离心等方法。浓缩：常用沉淀的方法。其好处是：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。常用方法如下：盐溶液沉淀：如MgCl2；NaAc；KAc等。有机溶剂沉淀：如乙醇；异丙醇；聚乙二醇（PEG）；精胺等。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。测定：一般选用紫外分光光度法或溴乙锭荧光法测定核酸的含量。保存：对DNA和RNA有不同的保存方式：对DNA：DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；长期保存样品中可加入1滴氯仿。对RNA：RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存；长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中；在RNA溶液中，加1滴0.2mol/L氧钒核糖核苷复合物冻贮于-70℃,可保存数年。2.脂质的分离纯化：I.注意：组织破碎的方法会影响提取的脂质的浓度，因此分析的时候必须将各种破碎方法进行比较。II.操作方法：按照Folchmethod法进行操作：先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取组织按1：20的量和氯仿/甲醇一起组织均浆，分层后在室温下在摇床中摇动15-20分钟。均浆通过滤纸过滤或者离心获得液体。在离心获得的液体中加入0.2倍体积的水或者0.9%的生理盐水，涡旋几秒钟混均，然后2000rpm离心得到两相溶液，如果需要的话用甲醇/水（1/1）的将两相界面洗一到两次，洗的过程不要让甲醇/水与下层混合。通过离心和虹吸去掉上层后，下层氯仿相含有脂质，如果体积在2-3ml以下则通过真空旋转蒸发器或在氮气下浓缩。二氯甲烷可以替代氯仿，结果表明二氯甲烷/甲醇能够取代氯仿/甲醇，因此能够避免氯仿带来的健康、安全和管理问题。3.糖类的分离纯化a.单、双糖：常见的单、双糖一般采用合成的方式。制备如下：脱脂→去杂→浓缩→再次去杂→脱色→浓缩→冷却→结晶（→进一步纯化）。b.多糖的分离纯化：脱脂：由于多糖被脂质包围，通常用醇或醚回流脱脂。提取：热水浸提法微波辅助提取法超声辅助法索氏提取法醇提法其它方法（如稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等）除杂：除蛋白质：沙维积法（Sevag法）；三氟三氯乙烷法；三氯醋酸法；酶解法；盐酸法；其它方法（如加入5%ZnSO4溶液和饱和Ba（OH）2溶液，振荡后离心去蛋白，但此方法不够彻底）。除色素：活性炭除色素；弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA－7来吸附色素（针对植物色素）；氧化脱色（糖和色素时结合，易被DEAE纤维素吸附，不能被水洗脱的）；依次用丙酮、无水乙醚和无水乙醇洗涤多糖；用4:1的氯仿-正丁醇除色素除低聚糖等小分子杂质：逆向流水透析法。纯化：分部沉淀法盐析法季铵盐沉淀法柱层析制备性区域电泳膜分离法金属络合物法其它方法（如超过滤法、活性炭柱色谱、LKB柱色谱系统等）c.黏多糖（酸性黏多糖）的分离纯化：定义：粘多糖是一类广泛存在于动物体内的含糖醛酸和氨基糖残基的复合多糖提取：黏多糖大多与蛋白质共价结合，首先常用酶降解部分蛋白或用碱使多糖-蛋白质间的键断裂，促进提取时的溶解。然后用普通蛋白沉淀法沉淀蛋白。分离：采用有机溶剂分离法、季铵化合物沉淀法或离子交换层析法即可。d.多糖的分析鉴定：含量的测定：测定方法：硫酸－苯酚法、硫酸－蒽酮法、比色定量法、分光光度法、纸色谱法、离子交换色谱法、yaphe法、薄层色谱法、酶法、原子吸收法、HPLC法、凝胶电泳法、亲和电泳法、连续流动分析法检测法、次亚碘酸盐定量法、蒽酮－硫酸法（总糖）、DNS法（还原法）、磷钼比色法、邻钾苯胺比色法等.每种方法只对某些多糖的测量效果好.比色法、分光光度法、离子交换色谱法、酶法和电泳法等可同时用于多糖的定性定量分析。纯度鉴定：多糖是高分子化合物，其纯品微观上是不均一的，通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分.多糖纯度鉴定的常用方法：超离心、高压电泳、凝胶层析、HLPC法等.现在应用较多的是HLPC法，旋光度测定也是纯度测定的一种方法。分子量的测定：多糖分子量的测定是研究多糖性质的一项重要工作.常用方法：渗透压法、蒸气压渗透剂法、端基法、粘度法、光散射法、凝胶色谱法、超过率法、沉淀法、凝胶电泳法、HPLC法、超离心分析法、分子筛色谱法、GPC法、MALDI－TOF－MS法.结构测定：多糖一级结构测定：多糖的一级结构分析，主要是分析组成多糖的单糖类型、数目、连接方式及苷建构型.常用化学法和仪器分析法。多糖高级结构测定：目前研究多糖的二级结构常用的手段是NMR技术。近年来，以精确三维结构知识为基础揭示重要生命活动的规律已达到前所未有的深度和广度。4.蛋白质的分离纯化（1）基本原理：一是利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；二是将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。纯化蛋白质大分子涉及纯度和产率实际中两者不能兼得，视目的而取舍。（2）前处理：定义：把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。选择适当的方法，破碎组织和细胞：动物组织和细胞：用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理法破碎；植物组织和细胞：使用石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理。细菌细胞：常用方法有超声波振荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。如果蛋白质主要集中在某一亚细胞，例如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞浆等。用差速离心方法分离，收集亚细胞组分材料。如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合，必须用超声波或去污剂使膜结构解聚。（3）粗分级：定义：选用一套适当方法，把蛋白质混合物提取液中，所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。方法：盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。（4）细分级：定义：样品的进一步提纯。方法：层析法：凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。电泳法：包括区带电泳、等电聚焦等（5）进一步分离纯化沉淀法：根据不同物质在溶剂中的溶解度不同，将目的蛋白质大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。包括：盐析、有机溶剂沉淀、结晶、等电点沉淀、选择性沉淀等离心：悬液中的各种粒子（细胞，细胞器及分子）有不同的分子量或密度，因此离心时有不同的速率。包括：差速离心、速率区带离心电泳：物质的电荷–质量比决定其在电场中移动的速度。各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。包括：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶（SDS-PAGE）、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳层析：溶液中的蛋白质分子能与固体表面进行结合及解离，但蛋白质