原位杂交原理

实验一IEF/SDS—聚丙烯酰胺凝胶双向电泳随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。自从澳大利亚学者Wilkins和Williams等人于1994年提出蛋白质组(Proteome)这一概念以来,国际上蛋白质组研究进展十分迅速,不论基础理论还是技术方法,都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立,相应的国际互联网站也层出不穷。1996年,澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心:AustraliaProteomeAnalysisFacility(APAF)。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国,各大药厂和公司在巨大财力的支持下,也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。国内从1997年开始开展蛋白质组研究，已建立起基本蛋白质组平台技术的有中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研究中心和军事医学科学院。目前年我国的蛋白质组研究进入了一个迅速发展的新阶段,其主要标志是国家科技部将蛋白质组研究确立为“973”和“863”的项目。蛋白质组学一经出现,就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法”,即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质,这种观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学,也更符合蛋白质组学的本质。但是,由于蛋白质表达随空间和时间不断变化,要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”,即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化,如蛋白质在不同环境下的差异表达,以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。一、实验原理聚丙烯酰胺双向电泳是一种由任意两个单向聚丙烯酰胺电泳组合而成的，在第一向电泳后再与第一向垂直的方向上进行第二向电泳的分离方法。其基本原理是第一项基于蛋白质的等电点不同在pH梯度胶内等电聚焦(Isoelectricfocusing)；第二项则根据分子量的不同大小进行ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分离,把复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。经过电荷和质量两次分离后,可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。IEF/SDS-PAGE双向电泳法是O′Farrall和Klose分别在1975年根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立的。采用IEF/SDS-PAGE分离蛋蛋白质，第一向IEF/SDS-PAGE所用的聚丙烯酰胺凝胶通常为柱状，第二向SDS-PAGE所用的为板状。IEF/SDS-PAGE与IEF-PAGE和SDS-PAGE的区别在于：1.第一向的电泳分离系统与相应的单向电泳不同。在进行第一向IEF-PAGE时，为保证被分离的各种蛋白质能够充分地与SDS结合以利于第二向SDS-PAGE的进一步分离，必须在第一向电泳系统内加入高浓度的尿素和适量的的非离子去污剂NP-40，而且溶解蛋白质样品的溶液中除了加入这两种试剂外还含有二硫苏糖醇(DTT)。这些试剂本身并不带电荷，不影响各蛋白质原有的电荷量和等电点，其作用在于破坏蛋白质分子内的二硫键，促使蛋白质变性和肽链舒展，从而有利于蛋白质分子在较为温和的条件下与SDS充分结合。2.第二向的加样操作与相应的单向电泳不同。经过第一向IEF-PAGE，蛋白质在第一向的凝胶柱内得到了初步的分离。在进行第二向SDS-PAG时，其加样方式是将第一向电泳后的凝胶柱包埋在第二向的凝胶板内，通常包埋于凝胶板的上端。由于第二向的电泳分离系统不同于第一向，因此必须将第一向电泳后的凝胶柱在包埋于第二向凝胶板之前，预先在第二向的电泳分离系统内进行震荡平衡。所用的平衡液通常与单向SDS-PAG所用的蛋白质样品处理液相一致，内含-巯基乙醇和SDS等。经过震荡平衡，凝胶柱内原有的第一向分离系统被第二向的电泳分离系统所取代。其中-巯基乙醇使蛋白质组分分子的二硫键保持还原状态，有利于SDS与蛋白质充分结合，从而完成第二向SDS-PAGE的样品处理，即可进行第二向电泳。二.实验步骤蛋白质提取：称取0.2g花生胚脱脂粉，加入１ml样品裂解液，冰浴中充分研磨，4℃、12000g离心10min，上清液置-20℃下备用。１．试剂配制：第一向试剂：1）样品裂解液(内含9.5mol/L尿素、2%非离子型去污剂NP-40、0.8%AmpholinepH5-7、0.8%AmpholinepH6-8、0.4%AmpholinepH3.5-10、2%二硫苏糖醇、5mmol/LK2CO3)：取5.7g新鲜尿素，2ml10%非离子型去污剂NP-40，0.2mlAmpholinepH5-7，0.2mlAmpholinepH6-8，0.1mlAmpholinepH3.5-10，0.2g二硫苏糖醇(DTT)，1ml50mmol/LK2CO3，用双蒸水定容到10ml。用eppendorf管分装，每管100l，置于－20℃冰箱保存。2）第一向凝胶储备液（含28.38%丙烯酰胺、1.62%甲叉双丙烯酰胺）：取7.09g丙烯酰胺溶于双蒸水后加入0.405g甲叉双丙烯酰胺。待溶解完全后定容至25ml，置于棕色瓶内于，4℃冰箱保存。3）第一向电极母液（临用前稀释10倍）：正电极母液（0.1mol磷酸）：取6.75ml磷酸，用去离子水定容至1000ml。负电极母掖（0.2molNaOH）：取16gNaOH，用去离子水定容至2000ml。4）样品覆盖掖（含8.0mol/L尿素、0.4%AmpholinepH5-7、0.4%AmpholinepH6-8、0.4%AmpholinepH3.5-10、5mmol/LK2CO3）：取新鲜尿素4.8g，0.1mlAmpholinepH5-7，0.1mlAmpholinepH6-8，0.1mlAmpholinepH3.5-10，1ml50mmol/LK2CO3，用双蒸水定容到10ml。用Eppendorf管分装，每管100ul，置于－20℃冰箱保存。5）平衡液(含10%甘油、5%-巯基乙醇、2.3gSDS、0.625mol/LTris-HCI、55ml甲醇)：取10ml甘油、5ml-巯基乙醇、0.5ml浓盐酸、2.3gSDS、0.757gTris，先用20ml双蒸水溶解，然后加入55ml甲醇，最后用双蒸水定容到100ml。置棕色瓶中于4℃冰箱保存。6）第二向凝胶储备液（丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=29:1）：取29g丙烯酰胺溶于双蒸水后加入1g甲叉双丙烯酰胺，待溶解完全后定容至100ml，置于棕色瓶内于4℃冰箱保存。7）分离胶缓冲液（1.5molTris-HCI，pH8.8）：取0.86gTris，溶于400ml双蒸水中，用浓盐酸调pH到8.8，最后定容至500ml。8）浓缩胶缓冲液（1.0molTris-HCI，pH6.8）：取0.56gTris，溶于400ml双蒸水中，用浓盐酸调pH到6.8，最后定容至500ml。9）SDS-PAGE电极贮存液（临用前稀释5倍）：900ml去离子水中溶解15.1gTris和94g甘氨酸，然后加入50ml10%(w/v)的电泳级SDS贮存液，用去离子水定容至1000ml。10）两性电解质载体：AmpholinepH3.5—10，AmpholinepH6—8，AmpholinepH5—7。3.操作方法:(1)等电聚焦凝胶柱的制备(10ml)试剂用量尿素（超级纯）5.5g第一向凝胶贮备液1.33mlAmpholinepH3.5—100.1mlAmpholinepH5—70.2mlAmpholinepH6—80.2mlK2CO350mmol/L0.5ml双蒸水1.47ml10%NP-402.0mlTEMED10l10%过硫酸铵12l(2)装管和聚合将废弃的50ml塑料离心管制成7-9cm的圆筒，封住圆筒的一端并垂直放在一玻璃板上，把制胶玻璃管用橡皮筋扎好，垂直放于圆筒内，在将配制好的凝胶（按制胶玻璃管所需用量）加入圆筒内，用注射器漫漫向圆筒注入蒸馏水，直至制胶玻璃管的凝胶达到所需位置(一般为9cm)。用微量注射器缓慢地在凝胶表面加上70-100l8M尿素溶液以隔绝空气。静置约1小时，让凝胶完全聚合，然后吸去尿素溶液，在凝胶表面加上25l样品裂解液，在小心加入25ul水，放置1-2小时，吸去水及样品裂解液，在加25ul新鲜的样品裂解液，其上覆盖以0.02mol/LNaOH溶液。(3)预电泳将制好的凝胶管底部用刀片切平，然后插入等电聚焦电泳槽中，下槽加0.01mol/L磷酸电极液，上槽加0.02mol/LNaOH电极液。下槽接正极，上槽接负极，打开电源，将电压调至200V、300V和400V，依次进行15分钟、30分钟和30分钟的预电泳，以除去未聚合的单体和其他杂质。(4)加样及电泳预电泳结束后，吸去上槽电极液以及凝胶表面上的溶液，用微量注射器将样品液加在胶面上，在样品液之上再小心加入25l的样品覆盖液。先用0.02mol/LNaOH电极液充满覆盖液的上方空隙，然后将上槽换以新配制的0.02mol/LNaOH电极液。将电压先恒定至400V电泳15小时，再恒定至800V1小时。(5)剥胶(6)固定与平衡：将凝胶柱用双蒸水洗2-3次，放入平衡液(含55%的甲醇)中平衡3-5min，然后换用新鲜的平衡液振荡平衡0.5-1h，最后用不含甲醇的新鲜平衡液洗1-2次，每次2min。第二向SDS-PAGE电泳：与一般SDS-PAGE电泳相同1.分离胶及浓缩胶制备试剂成分及用量分离胶(10ml)浓缩胶(10ml)水3.36.830%丙烯酰胺4.01.71.5mol//lTris-HCIpH8.82.51.251.0mol//lTris-HCIpH6.810%SDS0.10.110%Ap0.10.1TEMED4l10l2.标准蛋白质标记胶制作，用未电泳过的等电聚焦胶条切成8mm左右的胶段，放入煮沸过的蛋白质Marker溶液中浸泡10min即可。3.分离胶及浓缩胶的制作4.等电聚焦凝胶柱的包埋5.电泳：浓缩胶恒流30mA、分离胶恒流50-60mA6.剥胶7.染色及脱色：用考马斯亮蓝R-250对凝胶进行染色，脱色液含7%的冰醋酸和10%的乙醇。8.成像三.实验报告附录一、第二向电泳缓冲液的配制：分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HClpH8.8浓缩胶缓冲液：1.0mol/LTris-HClpH6.8二、染色液的配制900ml甲醇：900ml蒸馏水：200ml冰醋酸（内含2.5g考马斯亮蓝R-250)相关知识要使聚丙烯酰胺双向电泳能够得到较为精确的分离结果，组成双向电泳的两个单向电泳所依据的分离原理应该有很大的不同。以蛋白质混合组分得分离为例，如果两个单向电泳所依据的分离原理相似，那么所得到的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离斑点基本呈对角线分布，这种分离结果并不比单向电泳分离优越。1975年，O’Farrell等人根据不同组分之间的等电点差异和分子量差异为两种不同的分离原理，建立了IEF/SDS—聚丙烯酰胺凝胶双向电泳的分离技术，简称IEF/SDS-PAGE。目前认为，采用IEF/SDS-PAGE可分离5000个不同的蛋白组分。采用IEF/SDS-PAGE分离蛋蛋白质，第一向IEF/SDS-PAGE所用的聚丙烯酰胺凝胶通常为柱状，第二向SDS-PAGE所用的为板状。IEF/SDS-PAGE与IEF-PAGE和SDS-PAGE的区别：1.第一向的电泳分离系统与相应的单向电泳不同。在进行第一向IEF-PAGE时，为保证被分离的各种蛋白质能够充分地与SDS结合以利于第二向SDS-PAGE的进一步分离，必须在第一向电泳系统内加入高浓度的尿素和适量的的非离子去污剂NP-40，而且溶解蛋白质样品的溶液中除了加入这两种试剂外还含有二硫苏糖醇(DTT)。这些试剂本身并不带电荷，不影响各蛋白质原有的电荷量和等电点，其作用在于破坏蛋白质分子内的二硫键，促使蛋白质变性和肽链舒展，从而有利于蛋白质分子在较为温和的条件下与SDS充分结合。