实验四、PCR基因扩增

PCR基因扩增实验四一、实验目的1）学习掌握PCR反应原理2）掌握PCR技术的操作过程3）通过PCR获得银杏黄酮代谢过程中的一个关键酶基因——CHS基因（查尔酮异构酶基因）二、实验原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。三、实验试剂、材料、仪器试剂：TaqDNA聚合酶，PCR缓冲液（含MgCl2），dNTP（每种2.5mmol/L）混合物，引物(终浓度各0.5mol/L)；琼脂糖，50×TAE缓冲液，无菌双蒸水等材料：银杏DNA仪器：微量移液器，吸头，0.2mlPCR薄壁管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉等四、操作步骤1）取一个干净的PCR薄壁管2）往PCR管里面加入各种试剂：1μlPrimer11μlPrimer21μlDNA模板15μlPCR反应液12μl无菌ddH2O30μlNote3）设定好PCR反应程序如下：95℃4min95℃50s61℃1.5min35cycles72℃2min72℃10minEnd4）开始PCR5）1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果五、注意事项１）PCR非常灵敏，注意移液器的规范使用，保证各种反应试剂吸取的精确性。２）所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染；吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，不要互相污染试剂。3）PCR的所用试剂应在冰浴上化开，并且要充分混匀。六、作业1）将你PCR实验结果的电泳图片附在实验报告上，并根据图片分析你扩增的结果2）思考：有哪些因素会影响PCR的质量？DNA的结构（1）三磷酸核糖核苷NTP三磷酸脱氧核糖核苷dNTP三磷酸双脱氧核糖核苷ddNTP补充：PCR原理DNA的结构（2）A腺嘌呤G鸟嘌呤C胞嘧啶U尿嘧啶T胸腺嘧啶五种碱基A-TC-GDNA的结构（3）氢键维持了DNA的双螺旋结构DNA的复制（1）3’-OH进攻5’-PiDNA聚合酶催化DNA的延伸方向:5’-3’DNA的复制（2）DNA复制相关蛋白在复制起始点打开双链DNA，然后DNA解链酶结合到单链DNA上进一步解开双链DNADNA的复制（3）DNA的复制和体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入打开双链解链酶加热变性维持单链单链结合蛋白高温引物引物合成酶外源加入底物dNTP细胞内源外源加入聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液PCR循环--变性PCR循环--变性PCR循环--变性PCR循环—退火PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR整个过程讨论1：为何酶促反应需要那么高的温度为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板防止非特异性的引物退火延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度DNA聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶常规用的PCRDNA聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的DNA聚合酶。酶活性在100℃条件下，能保持几个小时。而其最适合酶促温度在72℃左右。讨论2：影响PCR质量的一些因素模板：选用纯度较高的DNA作模板，杂质蛋白和RNA的存在都会影响到DNA聚合酶与引物和模板的结合。目的片断：目的片断或者目的片断相邻的DNA含GC量较高，或者有重复序列存在，都会导致二级结构的存在。可在反应体系里加入DMSO，破坏模板的二级结构。引物的设计：引物太短，要求退火的温度就低，错配的可能性就大，再者，两条引物不能存在较长的互补片断。酶：纯度、可信度，碱基错配率1/10000。讨论3：PCR的应用从蓝藻里面克隆SOD(超氧化物歧化酶)SOD作用：清除人体内细胞中自由基抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰食品、保健品、药品、化妆品基因库检索SOD的序列设计引物以蓝藻总DNA位模板做PCR获得的基因片断连接在表达载体原核表达蛋白讨论3：PCR的应用检测粉末样品是否含有炭疽杆菌炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球生命力强、传染快、发作快、死亡率高。有两对引物是根据编码炭疽杆菌EF因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的EF因子同源。PCR产物是1247bp和208bp的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。用营养肉汤培养2小时取培养液直接作PCRPCR技术是现代分子生物学实验技术的一项重要的技术，这一点在你进入分子研究领域你会真切的感受到的——可以说，如果没有PCR仪现代分子实验研究寸步难行！