实验四、微生物大小的测定、显微镜直接计数法

实验四微生物大小的测定、显微镜直接计数法(一）、微生物大小的测定目的要求1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。2.增强微生物细胞大小的感性认识。实验原理镜台测微尺为中央部分刻有精确等分线的载玻片，将1mm等分100格，每格长0.01mm。只用于校正目镜测微尺。目镜测微尺是可放入目镜内的圆形小玻片，精确等分50小格或100小格。由于不同显微镜或不同目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，测量前需先用镜台测微尺进行校正。球菌以直径表示大小；杆菌用宽×长表示。实验器材菌种：啤酒酵母仪器：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺（一）酵母菌大小的测定安装目镜测微尺校正目镜测微尺将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。分别在低、高倍镜、油镜下用镜台测微尺校正目镜测微尺计算镜台测微尺：将1mm等分为100小格，每小格长0.01mm（即10μm）。目镜测微尺每格长度（μm）=（两重合线间镜台测微尺格数×10）/两重合线间目镜测微尺格数菌体大小测定取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，在高倍镜下测定酵母菌的长和宽。选择有代表性的10个细胞进行测定，取平均值。实验结果记录（书P48）1）将目镜测微尺校正结果填入下表接目镜放大倍数：——接物镜接物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度/um低倍镜高倍镜油镜2）将啤酒酵母测定结果填入下表测定次数目镜测微尺每格代表的长度/um宽长菌体大小范围/um目镜测微尺格数宽度/um目镜测微尺格数长度/um12345678910目的要求1.明确血细胞球计数板计数的原理。2.掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。（二）酵母菌的显微镜直接计数血球计数板的构造血球计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各有一个方格网。每个方格网共分9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度有两种规格：一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论哪种规格，每个大方格都由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，则每个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。基本原理实验器材菌种：啤酒酵母仪器：显微镜、血球计数板制备适当浓度的菌悬液取洁净的血球计数板盖上盖玻片静置5分钟用高倍镜计数加样品设5个中方格的总菌数为A，菌液稀释倍数为B计数板为25个中方格(本次试验)：1ml菌液的总菌数=A/5×25×104×B计数板为16个中方格：1ml菌液的总菌数=A/5×16×104×B注意事项取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡；一般样品稀释度要求每小格内约有5-10个菌体为宜；每个计数室选5个中格（4个角和中央）计数；位于格线上的菌体一般数上不数下，数右不数左；若芽体大小达到母细胞的一半，则作为两个菌体计数。血球计数板使用完毕，用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，以免损坏网格刻度；洗净后自行晾干或吹风机吹干。实验结果（书P92）测定你所制备的样品的含菌量。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数各中格中菌数AB二室平均值菌数/um12345第一室第二室思考题为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？（书P48）在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？？（书P48）根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？？（书92）