chapter03 Design medium and seed culture of Ferm

chapter3培养基设计与种子扩大培养发酵工程教研室（3＃303办公室）[e-mail]ng黄方一3.1培养基的基本要求3.2培养基的成分及来源3.3发酵培养基的类型3.4发酵培养基的设计与优化3.5种子的扩大培养FermentationEngineering黄方一§3.1培养基的基本要求3.1.1大规模发酵培养基的共性①单位培养基能够产生最大量的目的产物；②能够使目的产物的合成速率最大；③能够使副产物合成的量最少；④质量稳定、价格低廉、易长期获得；⑤不影响通气搅拌性能和后处理。FermentationEngineering黄方一3.1.2大规模发酵培养基的设计原则①必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分；②有利于提高单位营养物质的转化率；③有利于提高单位容积发酵罐的生产能力；④有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期；⑤尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化；⑥原料价格低廉，质量稳定，来源广泛；⑦提高氧的利用率，降低能耗；⑧有利于产品的分离、纯化，减少“三废”物质。FermentationEngineering黄方一§3.2培养基的成分及来源培养基是人工配制的供微生物或动植物细胞生长、繁殖、代谢和合成人们所需产物的营养物质和原料。培养基的基本要素碳源、氮源、无机盐和微量元素、水、生长调节物质。黄方一培养基的成分、功能及来源成分功能来源碳源氮源无机盐和微量元素水生长因子黄方一培养基的成分、功能及来源成分功能来源碳源为细胞提供能源及组成菌体细胞成分的骨架；提供菌体合成目的产物的原料，构成代谢产物糖类、脂类、有机酸、低碳糖、石油、天然气、CO2等氮源组成菌体细胞结构物质；合成含氮代谢产物；提供微生物能量有机N：豆/棉子饼、麸皮、玉米浆、酵母、酒糟等无机N：氨水、铵盐、硝酸盐等无机盐和微量元素构成菌体成分；作酶的组成或激活剂；调渗透压、pH、电位等P、Mg、S、Fe、Na、Cl、Zn、Co、Mn等盐及微量元素水良好溶剂，热导好；运输介质；维持cell形态；水合、脱水作用天然水、蒸馏水、自来水、纯净水等生长因子构成辅酶组分；促进生命活动进行维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶、固醇、胺类、C2-6直链或分支脂肪酸等黄方一种类碳源物质备注糖葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、半乳糖、乳糖、甘露糖、纤维二糖、纤维素、半纤维素、甲壳素等单糖优于双糖，己糖优于戊糖，淀粉优于纤维素，纯多糖优于杂多糖。有机酸糖酸、乳酸、柠檬酸、延胡索酸、高、低级脂肪酸、氨基酸等与糖类比效果较差，有机酸难进细胞，进后会导致pH下降。当环境缺碳源时，氨基酸可被微生物作为碳源利用。醇乙醇低浓度时被某些酵母菌和醋酸菌利用.脂脂肪、磷脂主要利用脂肪，在特定条件下将磷脂分解为甘油和脂肪酸，但需比糖更多的氧。烃天然气、石油、石油馏分、石蜡油等利用烃的M细胞表面有糖脂特殊吸收系统，将难溶烃充分乳化后吸收利用。CO2CO2为自养微生物所利用。碳酸盐NaHCO3、CaCO3、白垩等为自养微生物所利用。其他芳香族化合物、氰化物蛋白质、肋、核酸等利用这些物质的微生物在环境保护方面有重要作用。当缺碳源时，可被M作为碳源降解。3.2.1微生物的碳源黄方一种类氮源物质备注蛋白质类蛋白质及其不同程度降解产物(胨、肽、氨基酸等)大分子蛋白质难进入细胞，一些真菌和少数细菌能分泌胞外蛋白酶，将大分子蛋白质降解利用，而多数细菌只能利用相对分子质量较小其降解产物。氨及铵盐NH3、(NH4)2SO4等容易被微生物吸收利用硝酸盐KNO3等容易被微生物吸收利用分子氮N2固氮微生物可利用，但当环境中有化合态氮源时，固氮微生物就失去固氮能力。其他嘌呤、嘧啶、脲、胺、酰胺、氰化物大肠杆菌不能以嘧啶作为唯一氮源，在氮限量的葡萄糖培养基上生长时，可通过诱导作用先合成分解嘧啶的酶，然后再分解并利用嘧啶可不同程度地被微生物作为氮源加以利用。3.2.2微生物的氮源黄方一元素化合物形式生理功能磷KH2PO4，K2HPO4核酸、核蛋白、磷脂、辅酶及ATP等高能分子的成分，作为缓冲系统调节培养基pH。硫(NH4)2SO4，MgSO4含硫氨基酸(半胱氨酸、甲硫氨酸等)、维生素的成分，谷胱甘肽可调节胞内氧化还原电位。镁MgSO4己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、核酸聚合酶等活性中心组分，叶绿素和细菌叶绿素成分。钙CaCl2，Ca(NO3)2某些酶的辅因子，维持酶(如蛋白酶)的稳定性，芽孢和某些孢子形成所需，建立细菌感受态所需。钠NaCl细胞运输系统组分，维持细胞渗透压，维持某些酶的稳定性。钾KH2PO4，K2HPO4某些酶的辅因子，维持细胞渗透压，某些嗜盐细菌核糖体的稳定因子。铁FeSO4细胞色素及某些酶的组分，某些铁细菌的能源物质，合成叶绿素、白喉毒素所需。3.2.3无机盐及其生理功能黄方一元素生理功能锌存在于乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、醛缩酶、RNA与DNA聚合酶中锰存在于过氧化物歧化酶、柠檬酸合成酶中钼存在于硝酸盐还原酶、固氮酶、甲酸脱氢酶中硒存在于甘氨酸还原酶、甲酸脱氢酶中钴存在于谷氨酸变位酶中铜存在于细胞色素氧化酶中钨存在于甲酸脱氢酶中镍存在于脲酶中，为氢细菌生长所必需3.2.4微量元素及其生理功能黄方一3.2.5生长调节物质包括：生长因子、前体、促进剂、抑制剂（1）生长因子凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质。（2）前体加入到培养基中能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因其加入而有较大提高的一类化合物。（3）促进/抑制剂微生物细胞生长非必需的，但加入后却能显著提高/降低发酵产量的一些物质。黄方一维生素代谢功能微生物的需要量硫胺素(维生素B1)焦磷酸硫胺素是脱羧酶,转醛酶,转酮酶的辅基,与氧化脱羧和酮基转移有关金黄色葡萄球菌需要0.5mg/ml核黄素(维生素B2)黄素核苷酸(FMN和FAD)的前体,黄素蛋白的辅基,与氢的转移有关多数微生物能自己合成,少数细菌如乳酸菌,丙酸菌等需要补给烟酸NAD和NADP的前体,为脱氢酶的辅酶,与氢的转移有关多数微生物需要,弱氧化醋酸杆菌约需3ng/ml对氨基苯甲酸叶酸的前体,与一碳基团的转移有关乳酸菌等需要,弱氧化醋酸杆菌约需0.1ng/ml吡哆醇(维生素B6)磷酸吡哆醛氨基酸消旋酸,转氨酶与脱羧酶的辅基,与氨基酸消旋,脱羧,转氨有关乳酸菌和几种真菌需要.肠膜明串珠菌需要25mg/l泛酸辅酶A的前体,乙酰载体的辅基,与酰基转移有关乳酸菌等多种细菌和酵母菌需要,多数丝状真菌能合成叶酸辐酶F(四氢叶酸)与核酸合成有关乳酸菌,丙酸细菌等需要生物素(维生素H)多种羧化酶的辅基,在CO2固定,氨基酸和脂肪酸合成及糖代谢中起作用,油酸可部分代替生物素的作用乳酸菌等多种细菌需要,干酪乳杆菌约需1ng/ml维生素B12钴酰胺辅酶,与甲硫氨酸和胸腺嘧啶核苷酸的合成和异构化有关细菌普遍需要,真菌,防线菌大多能自己合成维生素的生理功能及微生物需要量FermentationEngineering黄方一§3.3发酵培养基的类型按营养物质的来源按培养基形态按生产用途按培养基功能黄方一发酵培养基的类型依据类型特点按营养物质的来源按培养基形态按生产用途按培养基功能黄方一发酵培养基的类型依据类型特点按营养物质的来源天然异养微生物生长，一般自养型微生物不能生长合成定量工作研究用，生长慢，营养成分简单半合成大多数微生物均能生长、繁殖按培养基形态液体培养种子和发酵时用固体用于菌种分离、保藏、观察、计数、鉴定等半固体液＋琼脂，微好氧细菌的培养或运动能力确定按生产用途斜面供细胞生长繁殖、保藏菌种或产孢子用，富含有机氮种子供孢子发芽和菌体生长繁殖，营养丰富、完整，浓度不高发酵供菌体生长繁殖和最大限度地获得目的产物用的按培养基功能选择不妨碍目的M生长，而抑制非目的M生长鉴别加营养物或化合物，将对象M与其他M区别黄方一培养基名称加入化学物质微生物代谢产物培养基特征性变化主要用途酪素培养基酪素胞外蛋白酶蛋白水解圈鉴别产蛋白酶菌株明胶培养基明胶胞外蛋白酶明胶液化鉴别产蛋白酶菌株油脂培养基食用油、土温中性红指示剂胞外脂肪酶由淡红色变成深红色鉴别产脂肪酶菌株淀粉培养基可溶性淀粉胞外淀粉酶淀粉水解圈鉴别产淀粉酶菌株H2S试验培养基醋酸铅H2S产生黑色沉淀鉴别产H2S菌株糖发酵培养基溴甲酚紫乳酸、醋酸、丙酸等由紫色变成黄色鉴别肠道细菌远藤氏培养基碱性复红、亚硫酸钠酸、乙醛带金属光泽深红色菌落鉴别水中大肠菌群伊红美蓝培养基伊红、美蓝酸带金属光泽深紫色菌落鉴别水中大肠菌群一些鉴别培养基FermentationEngineering黄方一§3.4发酵培养基的设计与优化3.4.1发酵培养基的设计原理（1）菌体的同化能力（2）培养基对菌体代谢的阻遏与诱导的影响（3）C:N对菌体代谢调节的重要性（4）pH对不同菌体代谢的影响淀粉水解糖生产技术FermentationEngineering黄方一培养基的设计原则有的放矢：培何菌？获产物？生产/实验？种子/发酵？营养协调：浓度与配比合适（C:N）条件适宜：pH、渗透压、CO2浓度、氧化还原电位等经济节约：以粗代精、以野代家、以废代好、以简代繁以烃代粮、以纤代糖、以氮代朊、以国代进FermentationEngineering黄方一3.4.2培养基的制造程序制造前的准备（器皿和原材料的准备）培养基的制造程序（1）材料用量的计算（2）培养基的制造记录（3）投料、配制（4）培养基PH值的调节（5）过滤与分装（6）培养基的灭菌和贮存培养基的质量控制（1）一般性状和无菌检查（2）培养基性能实验FermentationEngineering黄方一3.4.3发酵培养基的优化方法根据以前的经验以及在培养基成分确定时必须考虑的一些问题，初步确定可能的培养基组分；通过单因子优化实验确定最为适宜的各个培养基组分及其最适浓度；最后通过多因子实验，进一步优化培养基的各种成分及其最适浓度。由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。FermentationEngineering黄方一类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健（中文核心期刊）FermentationEngineering黄方一原培养基:FermentationEngineering黄方一初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)FermentationEngineering黄方一通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步实验：乙酸钠的浓度0.2%比较好FermentationEngineering黄方一结果：碳源：乙酸钠0.2%氮源：氯化铵0.2%酵母膏0.03%无机盐：复合无机盐0.05%FermentationEngineering黄方一正交设计确定优化的配方正交试验设计黄方一FermentationEngineering黄方一（改进后培养基）（原培养基）改进后培养基的发酵结果FermentationEngineering黄方一§3.5种子扩大培养目的：提供相当数量的代谢旺盛的种子。任务：不但要得到纯而壮的培养物，而且获得活力旺盛的接种数量足够的培养物。FermentationEngineering黄方一3.5.1工业微生物的培养类型静止培养（厌氧发酵）培养基→发酵罐→接种→不通空气发酵通气培养（好气发酵）深层固体通风制曲茄子瓶或瓷盘培养三角瓶摇床培养表面皿液态培养固态培养表面培养深层培养表面培养深层培养FermentationEngineering黄方一3.5.2种子制备过程(1)孢子制备放线菌孢子制备霉菌孢子的制备细菌孢子的制备(2)种子制备摇瓶种子制备种子罐种子制备一级种子：孢子或菌丝→小种罐→培养→一级种子二级种子：一级种→较大种罐→培养→二级种子三级种子：二级种→大种罐→培养→三级种子FermentationEngineering黄方一种子扩大培养流程图Ferm