重组载体质粒扩增流程

重组载体质粒扩增的实验步骤：Ⅰ、感受态细菌的制备（CaCl2化学转化法）准备：LB液体培养基、LB固体平板（含抗生素和未含抗生素）、0.1mol/L氯化钙溶液（预冷）、细菌冻存液（0.1Mol/LCaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油）、高压过的EP管等1、将适合的冻存菌（stbl3）挑取一点（枪头沾取一点）加入盛有1mlLB液体培养基的15ml离心管中；37℃，220rpm，摇菌培养1个小时（复苏)。2、取10μl以下刚复苏的stbl3涂布于非抗性的LB固体培养基上37℃过夜培养（纯化）。3、挑取20多个前一天培养的细菌菌落加入3mlLB液体培养基里37℃，220rpm，摇菌培养12个小时（扩增，需使细菌老化，因为下一步摇出的菌才可处于对数生长期）。4、以1：100的比例将3ml培养物转接于300mlLB培养基中，在37℃220rpm摇床上剧烈振荡培养约1.5-2小时（使细菌处于对数生长期，易于转化，可每半小时测一下OD600值，使其0.3-0.5）；5、制冰。以下步骤开始注意无菌操作：6．将所有培养好的菌液分装移至离心管中，在冰上冷却10分钟；7．4℃下3000g冷冻离心10分钟；8．弃去上清，加入30ml预冷0.1Mol/LCaCl2溶液，轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；9．4℃下3000g冷冻离心10分钟；10．弃去上清，加入5ml预冷0.1Mol/LCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细菌重新悬浮；11．4℃下3000g冷冻离心10分钟；12.弃去上清，加6ml0.1Mol/LCaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油混匀后，分装成100μl或200ul/EP管（4℃预冷），-80℃冷冻贮存备用。【练手实验中扩增摇菌时中途摇床关闭了一段时间（具体不详），后续接着摇菌过夜。离心时用的6000rpm，第二次离心时很快溶解，遂进行了第三次离心获取沉淀。配制冻存液忽视了甘油对氯化钙的稀释，用1.8ml50%的甘油加入4.2ml0.1mol/L的氯化钙，即氯化钙的浓度没有达到0.1mol/L。分装时每个EP管含有300μl的感受态细菌。】Ⅱ、重组载体质粒转化细菌及转化成功细菌（即转化子）的筛选准备：含筛选抗生素的固体培养基、冰、42℃水浴锅、37℃预热的培养基1、取100μl感受态细菌在冰上解冻，每管加质粒载体（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻弹以混匀内容物，在冰中放置30min。2、将EP管放到预加温到42℃的循环水浴中的浮板上，放置90s～2min，不要摇动EP管。3、快速将EP管转移到冰浴上中，使细菌冷却1～2min4、每离心管加400μlLB培养基，事先用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min至1H使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。5、将适当体积（10μl??）已转化的感受态细菌涂布到含相应抗生素抗性（100μg/ml的终浓度）的LB固体培养基上旋转均匀涂布直至有发涩的感觉，即使平板干燥，然后倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落（或者将质粒涂布均匀后在37℃孵箱里先正放培养30min左右，再倒放培养）。【练手实验中转化VSVG质粒的平板长了2个菌落，而Δ8.2质粒的平板貌似没有菌落形成。分析原因排除了平板氨苄青霉素浓度（100μg/ml）太高,可能有两个原因：1、复苏的细菌浓度低，操作时将100μl感受态细菌加入了800μl的培养基摇菌，并且只摇菌40min；2、涂板时量太少，只加了20μl的复苏菌涂布。总的来说可能种在平板上的细菌太少。】Ⅲ、转化细菌的扩增：准备：LB培养基1、挑取以上培养的转化细菌的单菌落（1至数个）于2.5ml有氨苄抗生素的LB液体培养基里37℃220rpm摇菌12H（扩增细菌）2、将上一步摇的2.5ml细菌加入250ml抗性LB液体培养基（氨苄青霉素）里，37℃220rpm摇菌24H（扩增质粒）注：扩增的质粒不能立即提取时可将所有菌液转移至离心瓶里6000rpm离心收集细菌沉淀，然后-20℃保存。【此次提质粒的细菌连同LB培养基一起冻存了，应把离心弃去培养基后仅冻存沉淀】Ⅳ、重组载体质粒提取及纯化（《详见试剂盒质粒提取步骤》）1用15ml离心管收集1-5ml菌液。12,000rpm离心1min，弃上清。●根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。2加入250μl溶液Ⅰ/RNaseA混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min。3加入250μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。●不可剧烈混和，否则会使染色体DNA断裂。●此步骤不宜超过5min。4加入350μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。512,000rpm室温离心10min，收集上清。6将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。●如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积（800μl），可将上清分次加入DNA纯化柱中。712,000rpm离心1min，弃滤液。●此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。8加入500μl溶液PB，12,000rpm离心1min，弃滤液。●此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。9加入500μl溶液W，12,000rpm离心1min，弃滤液。●溶液W初次使用前用无水乙醇按1:1.5稀释，即含60%乙醇。10加入500μl溶液W，12,000rpm离心1min，弃滤液。1112,000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。12将DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加50-100μl溶液Eluent，室温放置2min。●12,000rpm离心1min，管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA于-20℃保存●溶液Eluent可用无菌双蒸水代替，但其pH需为8.0-8.5。溶液Eluent的加入体积视质粒拷贝数多少、依质粒浓度要求而定。Ⅴ、重组载体质粒的浓度及纯度测定（紫外分光光度法）：测OD260、OD280（先将DNA50倍稀释即2μlDNA加入98μl溶液Eluent中，然后加入比色皿检测）质粒浓度=50×OD260×n（50为每OD260值代表50μg/ml的双链DNA；OD260为260nm的吸光光度值；n为稀释倍数）质粒纯度=OD260/OD280（比值在1.8-2.0比较纯）【此次提的质粒稀释50倍后OD260为0.121、OD280为0.123；所以浓度为302.5ng/ul；质粒纯度OD260/OD280为0.983，考虑蛋白参入太多】Ⅵ、重组载体质粒的鉴定：方法1：双酶切→电泳(插入片段在2Kb以上时)；直接DNA电泳可判断整个重组载体质粒是否正确。方法2：PCR（插入片段在2Kb以下时）→电泳方法3：送公司测序附：LB培养基将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml，浓度为100mg/ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml（还是100μg？）的终浓度添加于生长培养基。重组载体质粒转化细菌方法2：电转化Ⅰ、电感受态细胞的制备第一天：1.将适合的冻存菌（DH5α）挑取一点加入盛有1mlLB液体培养基的15ml离心管中；37℃，220rpm，摇菌培养1个小时（复苏）。2、取10μl以下刚复苏的DH5α涂布于非抗性的LB固体培养基上37℃过夜培养。3.高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用4.准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天：5、挑取单个前一天培养的细菌菌落加入3mlLB液体培养基里37℃，220rpm，摇菌培养12个小时。6.以1：100的比例取1ml菌液加入盛有100mlLB液体培养基的250ml摇瓶中37°C，220rpm，振摇2-3小时，定时监控OD.600值（培养1小时后每半小时测定一次）7.当O.D.600值达到0.3-0.4时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15min至30min8.将100ml培养基转移至离心瓶中，4°C2500rpm下离心10min，弃上清液。9.加入几毫升灭菌冰水用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞，然后加水至离心管的2/3体积稀释。10.4000rpm离心10分钟（还是2500rpm10min？），小心弃去上清液11.同步骤9用灭菌的冰水重悬浮细胞12.4000rpm离心10分钟，弃上清液13.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14.4000rpm离心10分钟，小心弃去上清液（甘油稀释的细菌离心后沉淀更松散，需小心弃液）15.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16.将细胞按100μl或200ul/管等份装入微量离心管，于-80°C保存。【可同时取100μl感受态细菌加0.01ngpuc18直接电穿孔转化，检测转化效率。次日观察转化子生长情况】Ⅱ、细胞转化1、事先用无水乙醇清洗浸泡在无水乙醇中的电击杯，于超净台吹干，将载体质粒（名称？）、800ul无抗生素LB和0.1CM的电击杯一起置于冰上预冷。2.在冰上解冻一管100μl的电感受态细胞，添加1-10μl载体质粒（体积？），冰上培育约5分钟。3.转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中，混匀后转入电击杯中.轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部.4.加载P1000（移液器），准备好800μlLB5.对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆,25μFd,2.5千伏）（检查时间常数，应该在3以上）6.按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。7.37°C220rpm下培养细胞40分钟至1小时以复原8.5000rpm,5分钟,弃上清剩100ul,涂布到带有抗生素（氨苄青霉素？）的琼脂平板上,放于37℃过夜培养，次日查看转化结果.