酵母细胞固定化

思考：现有葡萄糖溶液、葡萄糖异构酶溶液及其他必需的实验器材，请你设计实验，将葡萄糖转化成果糖。（葡萄糖异构酶的作用是催化葡萄糖转化成果糖）葡萄糖溶液2mL葡萄糖异构酶溶液2mL思考：现有葡萄糖溶液、葡萄糖异构酶溶液及其他必需的实验器材，请你设计实验，将葡萄糖转化成果糖。（葡萄糖异构酶的作用是催化葡萄糖转化成果糖）本实验中需要注意的事项有哪些？为什么？生产中，经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，生产出由葡萄糖和果糖（含量在42%左右）而组成的一种混合糖糖浆即高果糖浆。这种酶稳定性好，可持续发挥作用，但在溶解于葡萄糖溶液后，无法从糖浆中提取回收，浪费很大。如今，酶已经大规模地应用于食品、化工、轻纺、医药等各个领域。酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。1、酶缺点：将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。思考：面对这些实际问题，你有什么设想？2、固定化酶实例：用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆（1）高果糖浆：是指果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人类的健康更有益。（1）使固定化酶既能与反应物接触，又能与产物分离；（2）固定在载体上的酶可以被反复利用。思考：这种方法的优点是什么？反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高果糖的产量和质量。思考：在生产实际中是不是所有产物的产生都只是一种酶的催化就可完成？固定化酶的不足：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实际中很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能进行，所以操作比较麻烦。思考：由上述问题可见，使用固定化酶技术有哪些不足？怎么解决这些不足如：酿酒、制作酸奶，需要一系列酶催化才能完成。可采用固定化细胞技术。3、固定化细胞固定化酶是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术。固定化细胞是利用物理或化学方法将细胞固定在一定空间内的技术。包埋法化学结合法物理吸附法一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。思考：固定酶和细胞各适合采用什么方法？为什么？这是因为酶分子很小，酶容易从包埋材料中漏出。细胞个大，难以被吸附或结合。（1）从操作角度来考虑，你认为哪一种方法更容易?（2）哪一种方法对酶活性的影响更小?（3）固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶?（4）如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种方法?（5）如果反应物是大分子物质，又应该采用哪种方法?思考：A、固定化酶B、固定化细胞BB一系列酶BA因为大分子物质难以通过细胞膜。固定化细胞的应用受限制。固定化酶和固定化细胞常用的载体材料：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等本课题使用的是包埋法固定化酵母细胞，即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。本实验选用海藻酸钠作载体包埋酵母细胞。1、酵母细胞的活化二、实验操作（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化过程：称取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10ml。用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右，使其活化在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。二、实验操作（一）制备固定化酵母细胞2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液（1）过程：称取无水CaCl20.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml的蒸馏水，使其充分溶解，待用。（2）注意事项：溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果3、配制海藻酸钠溶液（1）过程：称取海藻酸钠，放入50ml小烧杯中，加入10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10ml。（2）注意事项加热时要用小火，或者间断加热反复几次，直到海藻酸钠溶化为止如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合（1）过程：将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中。（2）注意事项①溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌。②搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察5、固定化酵母细胞（1）过程：以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min左右即刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。1、酵母细胞的活化（一）制备固定化酵母细胞2、配置物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液3、配制海藻酸钠溶液4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合5、固定化酵母细胞关键浓度高低会影响固定化细胞的质量。实验探究一：海藻酸钠浓度对固定化细胞质量的影响海藻酸钠的用量g/10mL0.20.71.2凝胶珠的颜色凝胶珠的形状第1组第2组第3组海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠，且易成拖尾状；浓度过低，形成的凝胶珠颜色较浅，所包埋的酵母细胞的数目少较浅淡黄色淡黄色圆形圆形拖尾状实验探究二：注射器滴加的速度对固定化细胞质量的影响实验探究三：注射器滴加时与CaCl2液面的距离对固定化细胞质量的影响滴加速度过快，凝胶珠不呈圆形或椭圆形，而呈拖尾状或面条状滴加时离液面过低，凝胶珠也会呈拖尾状实验评价：①用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。②在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。（二）检验凝胶珠的质量是否合格（一）观察凝胶珠的颜色和形状①如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；②如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。（多选）右图为某同学利用海藻酸钠固定化酵母细胞的实验结果，出现此结果的可能原因有（）A．海藻酸钠浓度过高B．注射器中的溶液推进速度过快C．酵母细胞已经死亡D．注射器距离CaCl2溶液液面太近ABD（二）用固定化酵母细胞发酵（1）冲洗:将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2－3次，洗去凝胶珠表面多余的电解质溶液。1、过程（2）发酵：将150mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25℃下发酵24h。2、注意事项（1）控制好发酵温度，一般是室温25℃（2）发酵时间可视具体情况而定，一般时间稍长一些，效果明显。（3）可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理做对照实验。（二）用固定化酵母细胞发酵观察发酵的葡萄糖溶液实验评价：利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。课题延伸如果希望反复使用固定化酵母细胞，就需要避免其他微生物的污染。在工业生产中，细胞的固定化是在严格无菌的条件下进行的。同时还需控制好温度和pH等。