《血红蛋白的提取和分离》课件

知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：1、含量2、组成元素3、相对分子质量4、基本组成单位：结构简式：种类：5、氨基酸连接方式占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物C、H、O、N高分子化合物氨基酸RHCCOOHNH2脱水缩合知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：6、肽键7、分子结构8、蛋白质多样性的原因：(多样性的根本原因)9、蛋白质的鉴定方法氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘曲折叠（n条）CONH氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别10、生理功能细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者双缩脲试剂血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。本课题的主要内容如下：样品处理及粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和分离方法原理方法原理方法原理方法原理凝胶色谱法电泳一、基础知识:样品处理及粗分离的原理:1、分离生物大分子的基本思路是什么？2、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？3、为什么不用鸡的血红细胞而用猪的血红细胞作为实验材料？4、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质？一、基础知识--蛋白质提取和分离原理1、选用一定的物理或者化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2、形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。提取分离方法凝胶色谱法阅读并回答（P64）1、凝胶色谱法另一个名称是什么？2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据是什么？3、凝胶的实质是什么？4、凝胶色谱法的原理是什么？基础知识（一）凝胶色谱法1、凝胶色谱法的别名：分配色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。3、凝胶实质①性质：一些微小的多孔球体，球内含许多贯穿的通道；②化学本质：多糖类化合物：③实例：葡聚糖、琼脂糖：基础知识（一）凝胶色谱法2、依据的特性蛋白质分子量的大小。4、原理原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快基础知识（一）凝胶色谱法•用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质•A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快•C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快D•相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个•B1、之前在什么地方遇见过缓冲物质？2、缓冲物质有哪些？作用是什么？3、本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？（二）、缓冲溶液由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等缓冲溶液－－洗脱剂组成：作用：抵制外界酸碱对溶液pH的干扰，保持pH与体内环境基本一致。（二）、缓冲溶液基础知识（三）电泳阅读第65页的相关内容，回答以下问题：1、电泳的概念；2、电泳的原理；3、电泳的种类；4、SDS的作用。基础知识（三）电泳2．凝胶电泳法：(三)电泳1.电泳的概念指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.（1）原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。(三)电泳（2）类型：琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)（3）SDS作用为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS。电泳结果阳极使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异电泳结果阳极样品处理粗分离纯化纯度鉴定血液组成成分1.洗涤红细胞2.释放血红蛋白3.分离血红蛋白4.透析血红蛋白血红蛋白的提取和分离跳转血液组成成分阅读思考：1.血液由______和________两部分组成。2.血细胞中________细胞数量最多，红细胞的含量最高的有机化合物是_____________。3.该化合物是由_____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的___________基团。血浆血细胞红细胞血红蛋白2条α-肽链2条β-肽链亚铁血红素返回1.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤过程：血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色采集得到猪血初次离心后的结果3次洗涤后的结果返回2.释放血红蛋白阅读思考：1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？①目的分析：②蒸馏水的作用是______________________________。③加入甲苯的作用是____________________________。④充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。磁力搅拌器返回2、粗分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次：4层。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次返回4.透析血红蛋白练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质2、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A调节pHB维持红细胞的能量供应C防止微生物生长D防止血液凝固样品处理粗分离纯化纯度鉴定血液组成成分1.洗涤红细胞2.释放血红蛋白3.分离血红蛋白4.透析血红蛋白血红蛋白的提取和分离跳转纯化－－凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5－193.样品的加入和洗脱返回装配好的凝胶柱色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱（二）凝胶色谱操作（1）凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。返回2.凝胶色谱柱的装填1、凝胶的选择材料?G代表意义?2、简单步骤？3、注意点：实验操作（二）凝胶色谱操作1、选择交联葡聚糖凝胶（G-75）“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围,75表示凝胶的吸水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。2、固定色谱柱－－配凝胶悬液－－装填色谱柱－－洗涤平衡3、凝胶色谱柱的装填注意事项：（1）、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。（2）、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。（3）、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。（4）、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。3.样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。3.样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的血红蛋白•样品的加入和洗脱的操作不正确的是•A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面•B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内•C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口•D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面A•下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（）•A．可采集猪血作为实验材料B．用蒸馏水重复洗涤红细胞•C．血红蛋白释放后应低速短时间离心D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液A观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？知识总结血红蛋白的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。A相同B相反C相对D相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输有关。A血红蛋白B肌红蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白BA5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。A白细胞B血小板C红细胞D淋巴细胞6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）。A.NaClB.甲苯C.蒸馏水D.柠檬酸钠CD7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（）A无色透明的甲苯层B脂溶性物质的沉淀层C血红蛋白的水溶液D其他杂质的暗红色沉淀物C教学反馈1．凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。A温度BpHC渗透压D氧气浓度BB