药物质量控制1

1.(原始的)色谱图为什么要经过数字化才能成为色谱指纹图谱？色谱指纹图谱数字化包括哪些内容？一、基本概念1、指纹图谱(Fingerprint)指纹图谱是指某种或某产地样品中所共有的、具有特异性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。其特点在于通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别样品的真伪或产地。通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的制定，能有效控制样品的质量，确保样品的相对稳定。2、数字化色谱指纹图谱(numericalchromatographicfingerprint)数字化色谱指纹图谱(numericalchromatographicfingerprint)又称相对保留值指纹图谱，其原理是在所有参与比较鉴定样品的色谱图中确定一个在各鉴定样品中都有的色谱峰作为参比标准，然后求取所有色谱峰各自的相对保留值。将色谱峰保留值转化为漂移较少、相对稳定的相对保留值，以此作为色谱峰的定位依据，加上各自的峰面积等参数，构成色谱指纹图谱。然后以这些由色谱图转换成相对保留值的数字化色谱指纹图谱作为标准，对那些参与比较的样品进行研究。二、指纹图谱的发展、属性和作用指纹图谱的产生与发展[1]，指纹图谱技术应用于植物药质盆控制可以追溯到上世纪年代初，随着色谱技术尤其是薄层技术的发展，人们大量采用薄层色谱的方法将植物药中化学成分展开于由各种担体铺成的薄层板上。根据薄层板上斑点的位值、斑点大小、斑点颜色、斑点数目的多少来进行定性鉴别，这种薄层鉴别方法己具备了指纹图谱特征，并被广泛应用。80年代及90年代，由于薄层扫描仪的出现使得薄层鉴别方法得到进一步发展，日本和我国部分学者用当时的薄层扫描仪得到复方成药扫描图谱作为色谱指纹图尝试应用于药材及成药分析。现代新型的薄层扫配备有自动点样系统、成像系统、数据处理系统，可将薄层板色谱结果转变成类于液相的色谱图，薄层扫描色谱图与薄层色谱结果结合，相得益彰，使得薄层扫描术成为指纹图谱研究的主要方法之一。与此同时，高效液相技术得到了长足发展，随着植物药中化学成分的分离鉴定、活性成分的不断阐明，人们更多应用高效液相法行定性、定量分析。西方国家如德国、美国、加拿大等普遍采用高效液相色谱法对物药中己知及未知组分进行控制，并形成相应的规范。新近几年国内有关学术期刊刊登了一些应用高效液相色谱法研究指纹图谱的论文。何谓中药指纹图谱，谢培山教授将其定义为它是一种综合的，可量化的鉴别手段，现阶段，通过色谱指纹特征相似程度的比较，判断真伪、评价优略、考察稳定性和致性，是一种复合中药特色的质量控制模式之一[2]。整体性和和模糊性是它的基属性。中药新药等的质量控制水平，以中药注射剂为重点，逐步扩大指纹图谱等多方法在中药质量控制中的应用.国家药监局要求中药注射剂在固定中药材品种、产和采收期的前提下，制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。指纹图谱应满足专属性、重现性和实用性的技术要求。现在不仅国内，而且国际都取得了共识，即中药不是单一组分在起作用，而是药物的整体起作用。对于色谱纹图谱中的各色谱峰，并不要求对每个组分的化学结构都清楚，也不需要对呈现在谱中的每个组分都清楚地定量，只需不同批号的同一种药品的指纹图谱保持基本一。即指纹图谱分析强调准确的辨认，而不是精密的计算，比较图谱强调的是相似，不是相同。中药指纹图谱反映了该中药的化学组成及其含量分布状况，可实现对中的多组分和多指标分析，对鉴别药材的真伪优劣及其稳定性均具有非常重要的参考值。中药指纹图谱还可以解决标准品缺乏的难题。即使在没有标准品的情况下，仍可选择以道地药材为标准对各中药样品进行鉴别和进行质量控制[63]。三、指纹图谱的应用概况近几年，中药指纹图谱的研究逐渐深入，设计的方法种类繁多，包括:(l)、色谱法：传统的薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法和高效毛细管电泳法等；(2)、光谱法：紫光谱法和红外光谱法等；(3)、牌谱法：质谱法和核磁共振法等；(4)、其他方法：如x射线射法，分子生物学方法等.其中色谱学方法是主流方法，尤其是TLC、HPLC和GC已经成为大家所公认的三种常规的分析手段.四、色谱图经过数字化才能成为色谱指纹图谱的原因数字化色谱指纹图谱(numericalchromatographicfingerprint)又称相对保留值指纹图谱，其原理是在所有参与比较鉴定样品的色谱图中确定一个在各鉴定样品中都有的色谱峰作为参比标准，然后求取所有色谱峰各自的相对保留值。将色谱峰保留值转化为漂移较少、相对稳定的相对保留值，以此作为色谱峰的定位依据，加上各自的峰面积等参数，构成色谱指纹图谱。然后以这些由色谱图转换成相对保留值的数字化色谱指纹图谱作为标准，对那些参与比较的样品进行研究。如果以样品的色谱图外形直接作比较，将存在许多实验过程中的系统误差和鉴定者的主观误差，例如流速的波动、进样量的差异、固定相的流失、校填充情况的细微变化、流动相的微小改变等操作引起的误差。当用每个色谱峰相对保留值及其相对应的面积归一化值作比较时，减少了保留值的漂移的影响，保证了色谱峰的正确定位，增强了鉴定的客观性、科学性和公正性。通过使用这些量化指标，将使色谱指纹图谱技术在中药质控和质标中发挥更大的作用。五、色谱指纹图谱数字化的内容1、相对保留值α的计算在实验色谱条件下，色谱峰较多且相当密集，难以插入一个合适的参照物。选择一个出峰时间较居中、各样品中均存在的组分作内参照峰(可采用叠加法等方法予以标定)求出样品中所有峰的相对保留值α。α=tRi/tRstRi——各组分的出峰时间,tRs——内参照峰的出峰时间2、α值窗口的设定由于保留时间受各种实验因素的影响，每一次实验数据不可能完全一致，故对每个峰值的α值设定窗口如为1％或2％等，即通过大量的实验数据计算每个峰值的α值，取可信限在±l％或±2％的范围内。3、指纹图谱的建立按样品各色谱峰α值的大小次序排序，在每个α项下标出该组分的相对面积值(RA)或归一化面积值(Ar)即组成了样品的HPLC—FPS。归一化面积值(Ar)＝siAAAi——某样品中某个色谱峰的峰面积，As——某样品中参照峰的峰面积相对面积值(RA)＝AAi×100%Ai——某样品某个色谱峰的峰面积，∑A——标准样品的总峰面积值峰4、共有峰两个样品中具有相同α值的色谱峰为共有峰。若为多个样品所共有，则称为多个样品的共有峰。5、重叠率重叠率=待鉴药材峰数标准药材峰数共有峰2×100%由于共有峰意味着在两样品中的色谱峰位是相同的，它们在总出峰数中所占的比率反映了两者的相似程度，即重叠的百分率。6、n强峰在众多的色谱峰中．按其面积值的大小，选择列前的n个色谱峰为n强峰。一般以总峰数的1／5—1／3为宜。7、指纹图谱之间相似度的评价。参考文献[1]谢培山，中药色谱指纹图谱鉴别的概念、属性、技术与应用[J].中国中药杂志，2001，26(10):653.[2]谢培山.中药色谱指纹图谱[M].北京:人民卫生出版社，2005.[3]李兰、王学军、张立国.色谱指纹图谱及其在中药质量控制中的应用[z].天津药学，2002，14(6):6.2.阐述SPME的基本理论。一、基本概念1、固相微萃取(SolidPhaseMicro－extraction，SPME)固相微萃取技术(SolidPhaseMicro－extraction，SPME)集取样、萃取及富集于一体，操作简便，而且具有萃取速度快、操作成本低以及便于实现自动化［1－3］。被广泛应用于药物分析、烟草分析及食品风味的分析等［4］。SPME具有分析样品使用量少，对被测样品选择性高，溶质更易洗脱，几乎无空白值和重现性好等特点。此技术利用被测样品对活性固体表面(溶融石英纤维表面的涂层)有一定的吸附(吸收)亲和力达到被分离、富集的目的。目前已商品化的涂层有聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丙烯酸酯(PA)、聚二甲基硅氧烷/羧乙基(PDMS/CAR)、二乙烯基/羧乙基(DVB/CAR)聚二甲基硅氧烷/二乙烯基(PDMS/DVB)等［5］。固相微萃取(SolidPhaseMicro-extraction,SPME)在1990年出现，并且对其性能优化，实现了自动化。这种无溶剂的样品前处理技术能将采样、收集、富集于一体，由于固相微萃取操作简便，实验时间短，因此，在环境分析、食品安全、医学药学等方面有广泛的应用。固相微萃取的过程是先采用一根涂渍多聚物固定相的熔融石英纤维从液/气态基质中萃取待测物，一定时间后，将富集了待测物的纤维直接转移到色谱仪中，通过一定的方式解吸，然后进行分离分析。然而，SPDE仍有其自身难以克服的缺点:(l)纤维头价格昂贵、易碎、使用寿命短;(2)萃取头上的聚合物在使用过程中会有部分丢失，因而引起目标物峰高的改变，影响分析结果的精密度;(3)SPME和GC联用时，分析某些物质(如含氯农药，高分子量化合物象腐殖酸、蛋白质)纤维具有记忆效应，即使是提高解吸温度也很难消除这种现象。同时因为固相微萃取不是完全萃取，因此在定量上必须精确，否则难以达到应有的准确度。二、SPME装置固相微萃取装置由萃取头和手柄两部分组成，如图1所示图1固相微萃取装置萃取头是SPME装置的核心，其涂层遵循“相似相溶”的原则，涂层的极性与厚度必须与分析物的性质相匹配。理想的萃取头涂层应能满足:对于分析物要有较强的萃取能力;能在较短时间内达到吸附平衡;热解吸时分析物能迅速地从萃取头上解吸;所选萃取头必须具有良好的热稳定性。手柄主要是在采样时将萃取头推出，使萃取头直接暴露于环境空气中进行采样，无需动力。采样结束后，旋进萃取头即可。分析时，该装置直接插入色谱仪的进样口，用手柄推出萃取头，吸附在萃取头上的有机物就会在进样口进行热解吸。三、SPME的采样方式SPME技术集样品预处理和进样于一身，按照采样方式可分为三种。1、直接固相微萃取法直接萃取法是将纤维直接插入样品中，待测物从样品基体直接迁移到萃取纤维上，达到分配平衡后即可取出进行色谱分析。该方式适用于分析气体样品和洁净水样中的有机化合物，缺点是纤维的使用寿命比较短。2、顶空固相微萃取法顶空萃取是将纤维暴露于密封样品上方的气相中，萃取挥发到固体或液体样品顶空上的待测物。该方法由于是在液面上进行顶空萃取，可避免基体干扰和提高分析度。相对于直接萃取法，顶空法对扩散系数大的挥发性物质，更具有优势。3、膜保护萃取法纤维通过一个选择性的膜与样品隔离，待测物通过选择性膜吸附到纤维上，而样品中高分子量的化合物不能通过，从而排除基体干扰。该法可用于难挥发性化合物的分析。由于待测物先要扩散穿过膜，才能吸附到涂层上，所以萃取时间较长。四、SPME定量分析依据固相微萃取是基于待分析物在萃取介质（涂层）和样品基质间的分配系数。在使用某种液体涂层进行萃取时，在萃取平衡状态下和萃取前的待分析物的量应保持不变，有下列关系：LLSSVcVcVc00(1)式中：0c——样品中待分析物的初始浓度；Sc——平衡时样品中待分析物的浓度；Lc——平衡时涂层中待分析物的浓度；Vs——样品的体积；VL——涂层的体积。设待分析物在涂层和样品基质间的分配系数为KfS，待分析物在涂层中的吸附量为n,则SLfSccK/(2)LLVcn(3)将上边(2)、(3)代入式(1),整理得：SLfSSLfSVVKVcVKn0(4)(4)式表明，涂层的待分析物吸附量与样品中该物质的初始浓度呈线性关系，即待分析物在样品中的初始浓度越高，当达到吸附平衡时，涂层中被吸附物的量越大。因固相微萃取中使用的涂层物质对于大多数有机化合物都具有较强的亲和力，故KfS值对目标分析物来说特别大。这意味着固相微萃取具有很强的浓缩作用，因而对待分析物的检测具有较高的灵敏度。在式(4)中，若Vs很大(即VsKfsVL)，则涂层萃取被分析物的量与样品的体积无关：0cVKnLfS(5)根据这一理论模型，对于固定的萃取体系中的待测物而言，Kfs、VL和Vs是固定不变的。因此，当萃取体系达到平衡时，萃取涂层上吸附待测物的含量与待测物在样品中的初始浓度成正比。五、SPME的应用1、固相微萃取技术在食品痕量残留和