薄层色谱法

薄层色谱法薄层色谱法薄层色谱（简称TLC）是一种快捷、高效的分析方法。尤其适用于对某些微量及成分复杂难以分离的物质的分离测定。随着制剂向高质高效发展，浸出制剂、微粉制剂不断增加，薄层色谱方法成为一种广泛应用的方法。色谱法概念：色谱法是一种分离方法，它利用物质在两相中分配系数的微小差异，当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，这样原来微小的分配差异产生了很大的效果，使各组分分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。分配系数分配系数是广义的，包括溶解、吸附、离子交换、亲和力和分子体积等分离特性。物质能否分离取决于它们之间是否存在分配差异，这是一切分离的必要条件。与其它分离法相比，色谱法的高效率在于独特的“动态分离过程”，即反复多次分配，它大大扩大了原来分配系数的差异，从而实现混合物的分离。色谱法（又称层析法）根据其分离原理可分为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等。吸附色谱法是利用被分离物质在吸附剂上吸附能力的不同，用溶剂或气体洗脱使组分分离；常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱是利用被分离物质在两相中分配系数的不同使组分分离；其中一相被涂布或键合在固体载体上，称为固定相,另一相为液体或气体,称为流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上交换能力的不同使组分分离；常用的有不同强度的阳离子交换树脂、阴离子交换树脂，流动相为水或含有机溶剂的缓冲液。分子排阻色谱法又称凝胶色谱法，是利用被分离物质分子大小的不同导致在填料上渗透程度不同使组分分离；常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，根据固定相和供试品的性质选用水或有机溶剂作为流动相。色谱法又可根据分离方法分为：纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。所用溶剂应与供试品不起化学反应,纯度要求较高。分析时的温度,除气相色谱法或另有规定外，系指在室温操作。分离后各成分的检出，应采用各品种项下所规定的方法。采用纸色谱法、薄层色谱法或柱色谱法分离有色物质时，可根据其色带进行区分；分离无色物质时，可在短波(254nm)或长波(365nm)紫外光灯下检视，其中纸色谱或薄层色谱也可喷以显色剂使之显色，或在薄层色谱中用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光猝灭法检视。柱色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱法还可分部收集流出液后用适宜方法测定。由于色谱（包括电泳）分离的宏观特征之一是“差速迁移”，即样品同时进入色谱柱或在同一起始位置，经过“一定时空”的分离。可分为：◆内色谱：固定分离时间，各组分处在色谱或电泳分离通道上不同位置（如TLC的斑点位置）。◆外色谱：固定分离路程，各组分以不同时间流出色谱柱或到达检测器（色谱图）。距离和时间的测定是简便的和准确的。薄层色谱概念薄层色谱属于液-固吸附色谱。同柱色谱不同的是吸附剂被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂层。干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少量展开剂的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动。与柱色谱过程相同，经过在吸附剂和展开剂之间的多次吸附-溶解作用，将混合物中各组分分离成孤立的样点，实现混合物的分离。原理由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，当流动相流过固体表面时，混合物各组分在液-固两相间分配。吸附牢固的组分在流动相分配少，吸附弱的组分在流动相分配多。流动相流过时各组分会以不同的速率向上移动，吸附弱的组分以较快的速率向上移动。随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱实现混合物的分离。一、薄层色谱分析的基本技术（一）实验器材1、仪器与材料（1）玻板：除另有规定外，常用5cm×20cm、10cm×20cm、20cm×20cm规格的优质平板玻璃板，厚度最好为1～2mm的。要求表面及四边光滑平整薄层均匀，洗净后的玻璃应不附水珠；晾干后应无尘；贮存于干燥洁净处备用。（2）涂布器：应能使吸附剂在玻璃板上手工或自动涂成一层符合要求的均匀薄层。手工、半自动及自动涂布器，涂布厚度有固定厚度或可以调节的两种。手工铺板器是常用的简易涂布器。（3）点样器：可选用色谱用微量注射器。规格有10μl、20μl等。适合于任意体积的点样用。但点样量小于10μl者不易用50μl的微量注射器，可选用微升毛细管（定量点样毛细管），规格有0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl及10μl等，适用于相应体积的点样用。自动点样仪AS30，德国DESAGA﹡点样方式：非接触式点样。点样形状多种：点状，条带状。可重迭多次点样点样精度高：点样量：可以在0.1-10μl及0.1-100μL之间任意选择点样精度：0.5μl点样速度可依据样品溶剂性质而调节：3—120μl/s自动调节薄层板和点样口之间的间距，保证点样的准确度和重现性；（4）展开室：分立式展开室和卧式展开室两种。最常用的是立式双槽式展开缸（如图）。其主要用于薄层的处理。缸内有一块外形如山脉的玻璃楔，有效的将展开缸分为二个隔离室。应用方式有如下二种：①当用作常规的展开缸时，右槽盛满展开剂并用滤纸插入展开剂中贴在展开缸壁上，让薄层板置于空的左槽中达到平衡。一定时间后，小心的使缸倾斜溶剂转移至左槽，展开即可进行。②一个槽用于展开，而另一个槽放入不同的溶剂或者为了使吸附剂进行预处理，可以放入硫酸—水等湿度控制混合液。应用溶剂蒸气，可以改进吸附剂性质和提高分辩率。（5）显色用喷雾器：喷雾器应不受试剂腐蚀并能使显色剂呈细而均匀的雾状喷出。（6）紫外光灯：紫外光灯有365nm和254nm，前者多用于检视有荧光的斑点；后者一般用于检视在荧光背景下现出的暗色斑点。（7）暗室：视检时，暗室内不得有任何光源。暗室的明暗度是影响检出率的重要因素之一。三用紫外仪薄层扫描仪2、固定相或载体：最常用的吸附剂有硅胶G、硅胶GF254、、硅胶H、硅胶HF254；其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G等，其颗粒大小一般要求在10～40μm；又分无黏合剂和含黏合剂两种。市售硅胶已在硅胶中加入12～14%煅石膏作为黏合剂。硅胶H不含任何黏合剂。硅胶GF254为硅胶G并含无机荧光物质。如锰激活的硅酸锌Zn2Sio4:Mn在254nm紫外光灯下产生荧光。硅胶HF254混合有同上荧光物质。有些品种也使用聚酰胺薄膜。如：双黄连口服液。3、试剂要求用AR级。（二）实验操作的基本技术1、薄层板的制备：将1份吸附剂（如硅胶G）加3份水或0.2%～0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液在研钵中研杆沿一个方向充分研磨，调成均匀糊状物，去除表面的气泡后，倒入准备好的涂布器进行涂布（薄层厚度一般为0.25～0.5mm）。控制厚度的可用适宜的铺板器或控制吸附剂量。例如：取吸附剂10g加水或羧甲基纤维素钠溶液30ml（用羧甲基纤维素钠溶液时可多加一点）调成糊状可铺10×20cm板5块。取下涂好的薄层板进行振动，使涂好的薄层板表面均匀光滑，然后于室温下置水平台上晾干。在反射光及透射光下检视，表面应均匀、平整、无麻点、无气泡无破损及污染，如果是硅胶GF254板还应在紫外光灯254nm下检视，荧光应均匀清晰、无花纹。不同厂家不同批号的吸附剂加水量及研磨时间要求有所不同，如加有其他改性剂更是如此。调制吸附剂时应视情况略为调整水或羧甲基纤维素钠溶液的用量。0.2～0.5%羧甲基纤维素钠的配制：取羧甲基纤维素钠适量加水100ml，加热煮沸，直到完全溶解，放置，取上清液备用。注意，放置要充分。一般2～3天，否则板上易出现麻点。晾干的薄层板，于105℃～115℃干燥（活化）0.5～1小时，置干燥器中冷却备用。不易将热板在空气中冷却后直接使用。这样板又可吸收空气中的水分而失活。为防止边缘效应，使用前刮去硅胶层两边缘几毫米。2、供试品的制备：按照各药品质量标准规定的方法进行提取分离。制得的供试品应放置于密塞的小瓶中，防止溶剂挥发影响点样量。3、对照品溶液的制备：对照品溶液又分为单成分对照品溶液，如甘草次酸，橙皮苷等。可按质量标准规定精配成一定浓度的对照品溶液，置密塞小瓶中备用。标准药材对照溶液，一般需照供试品的制备方法制备。在使用对照品溶液时一定要注意将取样的毛细管充分洗干净，防止造成对照品污染。4、点样：按规定吸取溶液用定量点样毛细管或色谱用微量注射器点样于薄层板上。点样基线距底边的距离，视所用板的大小为1～2cm，点间距离视板扩散情况以不影响检出为宜，一般为1cm。点样直径一般应小于5cm。两个以上的点样应在同一水平线上，并与薄层板的底边平行。点样时必须注意勿损伤薄层表面。溶液宜分次点加，每次加后任其自然干燥或吹干。高效薄层板点样1～2（～5）μl，样点直径1mm为宜。自动点样器毛细管点样5、展开剂的配置：展开剂要求新鲜配置，配置展开剂的各种溶剂应分别量取，不应用一支量筒递加。如有分层则按规定要求放置分层后，分取需要的上层或下层备用。应注意放置分层的温度和时间这是可能影响展开剂实际配比的因素。每次展开应更换新的展开剂。6、展开室的饱和：展开室的饱和是指，展开前和展开中溶剂系统所有组分在整个展开室空间达到饱和。展开室的饱和度直接影响Rf值。7、薄层板的预饱和：必要时，可以将点样后的薄层板置内有展开剂或规定的试液的展开室中放置一定时间进行预饱和，起到克服边缘效应及改善分离效果等作用。用双槽展开室很容易做到，即先将点好样品的薄层板放入展开室没有溶剂的一侧槽中，平衡后再将溶剂倾入此槽中展开。8、展开：将展开室置于水平位置，将点好样品的薄层板放入加有展开剂的展开室中，薄层板浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭，待展开至规定距离，除另有规定外，一般为8～15cm，取出薄层板，晾干，以备检测。一般采用上行展开。采用二次展开的，第一次展开的展距为7cm；高效薄层板的展距一般不超过7cm。少数沸点较高、扩散系数较低的溶剂系统（如异辛烷、正丁醇等）适当延长展距可提高分离度。但过度延长展距会使斑点扩散。9、斑点的检出：将展开后的薄层板从展开槽中取出，挥尽展开剂，应用下列几种方法对被分离的化合物进行检出定位。光学检出法：a：化合物本身有色，在自然光下可直接看出斑点。b：有些化合物在可见光下不显色，但可吸收紫外线光，在紫外光灯下显现不同颜色的暗点。c：有些化合物不仅能吸收紫外光，而且能发射更长波长的光而显现不同颜色的荧光斑点。荧光灯有短波型（254nm）和长波型（365nm）两种，有的化合物需在短波荧光灯下观察，有的化合物需在长波长荧光灯下检出即可。d：在可见光、紫外光下都不显示，也没有合适显色方法的化合物，可以用荧光薄层法进行分离。化合物在紫外光灯可以发亮的背景上显示暗点。这是由于这些化合物减弱了吸附剂中荧光物质的紫外吸收强度、引起了荧光的淬灭。光学检出法不仅方便，而且不会改变化合物的性质。对光敏感的化合物要注意避光，以及尽量缩短用紫外光灯照射的时间。e：显色剂法薄层色谱用的显色试剂较纸色谱广泛，可喷以能与被测化合物有专属性反应的各种试剂。有些化合物如果没有较灵敏的反应，也可喷以硫酸使斑点炭化（采用CMC—Na粘合薄层板时不适用），或者碘的氯仿溶液、碱性高锰酸钾溶液和磷钼酸等通用显色剂。除用喷雾法外、可用浸渍法处理薄层，便生成颜色稳定、轮廓清楚、灵敏度高的色斑。但浸渍法对软板不适用。利用某些物质的蒸汽与样品作用生成不同颜色或产生荧光，也可用于斑点的检出。多数有机化合物能吸附碘蒸汽而显示黄色斑点。有些化合物遇碘蒸汽后发生紫外吸收的变化或产生极强的荧光。挥发性的酸、碱，如盐酸、硝酸、浓氨水、二乙胺等蒸汽也常用于斑点的检出。二、薄层色谱分析的一般步骤样品的预处理及供试品溶液、对照品、对照品药材溶液的制备。首先要分析样品中待测成分与干扰成分的性质，选择适当的提取溶剂及精制方法，样品预处理的目的是为了得到清晰