第六章 植物的花药与花粉培养

20第六章植物花药和花粉培养第一节花药和花粉培养的意义花药是植物花的雄性器官，包括体细胞性质的药壁和药隔组织，以及雄性性细胞的花粉粒。按染色体的倍性来看，前者为二倍体细胞，后者为单倍体细胞。因此，花药培养属器官培养，花粉培养属细胞培养，但花药培养和花粉培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。一、花药和花粉培养的概念1.花药培养的概念：是指将花粉发育到一定阶段的完整花药接种到培养基上，诱导形成单倍体再生植株的技术。2.花粉培养的概念：是指将离体的花粉粒接种到培养基上，诱导形成单倍体再生植株的技术。二、花药和花粉培养的意义研究减数分裂，花粉生长机制的生理、生化、遗传等基础理论的最好方法快速获得纯合二倍体植株（纯系）有利于尽早淘汰隐性的有害个体，筛选出具有优良性状的个体第二节单倍体的概念及发生方式一、植物单倍体的概念1、单倍体（Haploid）：指具有配子体染色体组的孢子体。2、单倍体细胞：具有体细胞一半染色体的细胞。3、单倍体植株：单倍体细胞在离体条件下进行培养，使其发育成植株。二、单倍体的发生方式孤雌生殖：由胚囊中未受精的卵细胞发育成胚，进一步发育成单倍体植物。孤雄生殖：在传粉后卵细胞退化消失，由精细胞单性发育成为单倍体植物。无融合生殖：由胚囊中卵细胞以外的其它细胞，发育成的单倍体植株。如反足细胞、助细胞等。人工诱发单倍体：途径：A.1966年前:人工生产单倍体方法，有激素处理、远缘杂交、延迟受粉、用照射花粉授粉。B.目前:⑴离体花粉或花药培养，诱发小孢子单性发育成单倍体植物。⑵离体培养未受精的子房和胚珠，诱导卵细胞单性发育成植物体。三、单倍体育种的应用①缩短育种年限，加速F1代杂合体的纯化。②利用单倍体易于检测突变和恢复重组，发现隐性突变体，研究遗传分析的良好技术。③对于二倍体植物加倍变成四倍体或倍数更高的多倍体，可以改善原来植物的某些经济性状，满足人类的要求。④对异花授粉植物的单倍体植株进行加倍，可迅速获得自交系，免去人工自交的过程，节省大量的时间和人力。第三节植物花药与花粉培养一、概念花药与花粉培养：以离体的花药或花粉为外植体,在人工培养基中,使其发育成完整植株的技术。目的：诱导产生单倍体植株。雄蕊结构：花药是花的雄性器官。包括花丝、花药两部分。其中花药部分由药隔（2n）和花粉粒(1n)组成。花粉粒（也称小孢子）是由花粉母细胞经减数分裂形成。它的染色体数目为体细胞的一半，为单倍体细胞。各种植物的花粉粒表面结构图花药与花粉培养与单倍体植物的形成二、影响花粉培养的因素1花粉发育时期对花粉培养的影响花粉发育时期是否合适，是花药培养成功的关键。大多数单核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或愈伤组织。培养花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进行细胞学花粉发育时期的镜检。2材料处理对花粉培养的影响（1）低温度处理：Nitsch（1973）发现低温处理可以明显提高花粉胚的诱导率，3℃下保存48h，然后花药接种，花粉胚的诱导率提高了33.6%。低温处理对农作物花药培养同样有效。烟草花药7～9℃下7～14d为宜；水稻处理10℃、48h；小麦和黑麦需在1～3℃下2～20d得到良好效果。（2）离心处理Tanaka（1973）将单核后期的烟草花药在10000～11000r/min的速度下离心30min，产生小植株的频率从30.5%提高38.2%，每个花药产生的小植株数目从对照的平均1.6株提高到5.4株。（3）乙烯处理Bennett和Hughes(1972)在研究小麦化学去雄时注意到，在减数分裂前用乙烯利喷施植株，促使花粉细胞核发生分裂。王敬驹（1979）在培养基中及植株上分别施加乙烯利，结果发现在小麦花药培养基中较低浓度的乙烯利（40～80ppm）对花粉的愈伤组织的形成有促进作用。三、花药和花粉培养技术1花药培养将发育到一定阶段的花药，培养在人工合成的培养基上，使花药内花粉粒的发育途径发生改变，形成花粉胚或花粉愈伤组织，随后由胚状体或愈伤组织分化成植株。花药培养产生的花粉植株一般有两条途径：A.花药中的花粉通过胚状体阶段发育为小植株，例如烟草、曼佗罗等。B.花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再诱导分化植株。2、花粉培养从花药中游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分化启动发育为单倍体植株的技术。特点:它可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤组织的干扰，可以获得大量的花粉植株。1）花粉的分离与纯化：分离法：自然散落法、挤压法、机械游离法（磁力搅拌）纯化：用不同孔径的无菌筛子除杂。2）花粉培养的方式：①平板培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形成花粉胚状体，最终分化为植株。②液体培养:悬浮培养，通气性差。③双层培养：上-液体+下-固体④看护培养：花粉-滤纸-固体培养基⑤条件培养基：在花药培养基中加入失活的花药提取物。采用看护培养法：无菌条件下，将花药接种在固体培养基上→在每个花药上覆盖一小块圆片滤纸→用移液管吸取l滴每毫升含10个花粉粒的悬浮液接种在滤纸中央→形成胚状体→分化为单倍体植株。由于完整的花药发育过程释放出有利于花粉发育的物质，并通过滤纸供给花粉，促进了花粉的发育。四、花粉植株的倍性1诱导单倍体植株的倍性1)花药培养形成单倍体植株。但花药中的药壁、药隔等为二倍体组织也可能被诱导发育成植株。2）经染色体组型分析，花药培养中发现有非单倍体植株的存在。3）激素对倍性变化有很大影响。通过胚状体产生的花粉植株，几乎都是单倍体。而经过愈伤组织产的花粉植株中不少是二倍体。愈伤组织继代培养时间愈长，二倍体的比例愈高。2单倍体植株的染色体加倍1）人工诱导染色体加倍常用化学诱导方法，有秋水仙素、富民农、对二氯苯、8-羟基喹啉等。2）秋水仙素是由地中海生长的一种百合科植物秋水仙的种子和球茎提取出来的物质。能溶于水、酒精，可阻止细胞有丝分裂时纺锤丝的形成。（1）小苗浸泡加倍：双子叶植物烟草用0.4%秋水仙素溶液处理48h，加倍率为35%。（2）顶芽或腋芽处理加倍：将适宜浓度的秋水仙素水溶液，或调和在载体羊毛脂中，处理植株的顶芽或腋芽，诱导其分生组织的加倍。（3）培养基加倍：用单倍体植株的营养体置于一种适当的培养基上，诱导形成愈伤组织，然后再放到分化培养基上，再生植株。五、例子：小麦花药培养程序1、取材：用醋酸洋红涂片镜检，选取小孢子处于单核中期的麦穗，外部形态为：旗叶叶耳与其下一叶的叶耳距为5-15厘米。2、预处理：将穗子用湿纱布包好，放在塑料袋中，置于3-5℃冰箱中预处理3-5天。3、接种：70%表面消毒，将叶鞘剥除，无菌条件下，将颖壳上端1/3剪掉，镊子将花药轻轻拿出，接种到：N6+2，4-D（2mg/L）+KT(0.5mg/L)+蔗糖10%，温度25℃，暗中培养。4、分化：愈伤组织1-2毫米时，转入分化培养基中，N6+2NAA（0.5mg/L）+KT(0.5mg/L)+蔗糖3%，温度25℃，光照10h/d.5、移栽：2周后，出根、芽。当花粉植株长到2-3个真叶时，可转入1/2MS培养基中。低温弱光下练苗后可移栽于大田或温室中。六、单倍体植株的应用染色体加倍在植物育种中有重要的意义。1．单倍体植株的染色体加倍，可形成纯合的二倍体，恢复植物育性，缩短新品种的选育周期；由于以花药培养可得到大量的倍体植株。因此成为单倍体育种的有利工具，用花药培养进行单倍体育种的优点是缩短育种年限，加速F1代杂合体的纯化。2．对于二倍体植物加倍变成四倍体或倍数更高的多倍体，可以改善原来植物的某些经济性状。3．对异花授粉作物（如玉米）的单倍体植株进行加倍，可迅速获得自交系，免去了烦琐的人工自交过程，节省大量的时间和人力。4．排除显隐性基因干扰，有利于进行突变体选择：突变一般为隐性突变，隐性突变在二倍体中表现机会极低。对于一对杂合基因（A-a）而言，杂合体种子繁殖后代中显性纯合体AA和隐性纯合体aa出现概率1/4，而单倍体纯合出现概率1/2。如为n对杂合等位基因，单倍体育种比常规育种选择效率提高2n倍。例如，烟草“早育1号”，1971年从杂交的F1植株上取下花药进行培养，植株加倍，当年获得种子。1972年播66株纯合二倍体烟草种子，进行纯合度鉴定，从中选出两个较好株系。1973年在大田中进行生产示范，经全国会议现场鉴定，正式确定为烟草新品种，总共经四年时间就育成了新品种。中国农科院李梅芳水稻品种的中花8号、9号等累积推广超过1000万亩；北京农林科学院胡道芬（1984）小麦新品种京花1号、3号、5号等。1989甘肃农业大学培育的甘春16号春小麦。广西（1992）玉米所育成的“桂三1号”玉米杂交种，是国内外用花培方法育成的第一个玉米杂交种。