10基地班基因工程习题与考纲

福建农林大学生命科学学院2010级生物学基地班1第一章基因工程的含义及其基本环节包括哪些基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。具有以下几个重要特征：（1）打破物种的界限，实现跨物种的基因转移；（2）通过已知功能基因的遗传转化，可进行物种的定向改良；（3）可以创造出自然界中原本没有的生物。它包括以下环节：①目的基因克隆；②载体的准备；③目的基因与载体的连接；④重组DNA转化/转染/转导；⑤重组体的筛选与鉴定；⑥重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用基因工程的基本条件及各自的作用有哪些①目的基因:是开展基因工程的目标和物质基础。②载体:是运载工具，引入的外源基因到宿主细胞中，使其进行复制或表达。③工具酶:指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶。④受体细胞:摄取外源目的DNA并使其稳定维持和表达。基因工程的基本技术策略及其具体实施方案（1）强化基因的表达，通过增强目标性状对应基因的拷贝数，提高目的酶表达量与活性，实现目标性状的改良。（2）关闭特定基因的表达，实现目标性状的改良。（3）基因的异源表达赋予生物新的功能。第二章限制修饰系统及其在基因工程中的应用限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶的作用，破坏入侵的DNA，导致寄主幅度受到限制。修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。寄主控制的限制与修饰的作用:一是保护自身的DNA不受限制；二是破坏外源DNA使之迅速降解。基因工程中的应用：应采用缺少限制作用的菌株作为受体。限制性内切酶含义及其类型一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并切割DNA双链结构的内切核酸酶。类型：已鉴定出的限制性内切核酸酶可分为4种不同类型：I型酶（TypeI）、II型酶（TypeII）、III型酶（TypeIII）和IV型酶（TypeVI）。限制性内切酶II为何是DNA重组技术中最常用的工具酶？它具有哪些特性？II型限制性内切核酸酶只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在，其识别和切割DNA分子具有严格的特异性。①识别序列的特异性：识别序列为4-6bp的双重螺旋对称结构的回文序列②切割位点的特异性：在识别序列处特异地切割双链DNA分子，水解磷酸二酯键，产生3’端羟基、5’端磷酸基团的DNA片段。福建农林大学生命科学学院2010级生物学基地班2同切点酶、同尾酶的含义及其在基因工程中的应用同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同的微生物、能识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。基因工程中可以利用用同裂酶对甲基化位点的敏感性不同进行同样的切割，产生不同或相同的末端。同尾酶：来源不同，识别靶序列也不同，但切割后能产生相同的黏性末端的限制性内切核酸酶。同尾酶可便于克隆载体的改造和构建，且可用于消除某些限制酶切点，但如果要回收重组克隆中的插入片段时，则要慎重选择适当的同尾酶。限制性内切酶的星活性及其在使用过程中如何加以避免酶的星号活性（staractivity）：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。应该避免：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，尽量遵循生产商推荐的反应条件。DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化含义及其应用完全酶切消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。部分酶切消化：内切酶在DNA上的所有位点只有部分被切开。在实验中，通常通过缩短酶切消化的反应时间或降低反应温度以约束酶的活性以达到部分消化的目的。根据DNA重组设计的需要，特异性地创造部分酶切的条件，可以获得需要的DNA片段，例如，在构建真核生物大片段插入基因组文库时，需要对基因组DNA进行随机的部分消化，才能得到一系列相互重叠的片段。DNA连接酶含义及其催化的连接反应特点有哪些DNA连接酶（DNAligase）：是能催化双链DNA片段靠在一起的3’羟基末端与5’磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。连接反应特点：1.连接反应需要在一条DNA链的3’末端具有一个游离的羟基、而另一条DNA链的5’末端具有一个游离的磷酸基团，才能发挥其连接DNA分子功能；2.连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活因子；3.DNA连接酶只能连接缺口，不能连接裂口；4.被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分，不能够连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子。大肠杆菌DNA聚合酶I有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值？（1）5'→3'聚合酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I的聚合酶活性是以DNA为模板，利用体系中的4种脱氧核糖核苷（dNTP），催化单核苷酸分子加到引物的3'-OH末端，沿5'→3'合成与模板互补的另一条DNA链。（2）3'→5'外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I的3'→5'外切酶活性是沿3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸，这种外切酶活性在体内DNA复制时主要起校对作用。（3）5'→3'外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性，是从5'端降解双链DNA分子。它也可福建农林大学生命科学学院2010级生物学基地班3以降解DNA:RNA杂合体中的RNA分子，即具有RNA酶H的活性。用途：1）除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）（3'→5'外切酶活性）2）补齐5’-突起端（5'→3'聚合酶活性）3）合成第二条cDNA4）切口移位制备探针(5'→3'外切酶活性)Klenow片段和DNApolyI有何异同大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow片段。Klenow片段仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。DNApolyI具有以上三种的酶活性。为什么说反转录酶是一种特殊的DNA聚合酶，其主要作用是什么反转录酶普遍存在于含RNA的反转录病毒中，它以RNA为模板，催化合成互补的DNA（complementaryDNA，cDNA）单链，进而合成DNA第二条链。它具有合成DNA的功能，但是所用的模板是RNA，所以是一种特殊的DNA聚合酶。主要作用：1.以mRNA为模板合成其互补DNA（cDNA），用于构建cDNA文库和基因克隆；2.对具5’端突出的DNA片段的3’端进行补平和标记，制备杂交探针；3.代替大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段或测序酶，用于DNA序列分析。末端脱氧核苷酸转移酶、T4多核苷酸激酶以及碱性磷酸酶的含义及其在基因工程中的应用末端脱氧核苷酸转移酶：简称末端转移酶，一般从小牛胸腺中提取的一种碱性蛋白，是一种在不需要模板的情况下将脱氧核苷酸添加到DNA分子的3'-OH末端的酶，催化过程中伴随无机磷酸的释放。末端转移酶主要用途有：（1）用于克隆DNA片段；（2）用于DNA片段3‘末端标记；（3）按照模板合成多聚核糖核苷同聚物T4多核苷酸激酶：T4多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基转移到DNA或RNA的5'－OH末端，使已脱磷酸化的5'末端重新磷酸化。应用：1.标记DNA或RNA的5'末端；2.在DNA分子连接时，对缺乏5'磷酸基团的DNA片段或人工合成接头进行磷酸化处理。碱性磷酸酶：碱性磷酸酶能够催化核酸分子脱掉5'的磷酸基团，从而使DNA（或RNA）片段的5'－P末端转换成5'－OH末端。碱性磷酸酶在基因工程中的用途：1.DNA分子片段5'末端的去磷酸化，防止自身连接；2.在5'末端标记之前，去除DNA或RNA分子的5'末端磷酸基团。核糖核酸酶H的含义及其应用核糖核酸酶H（RNaseH）催化DNA:RNA杂合链中的RNA部分的内切降解作用。应用：1.（特异地降解DNA）改为能特异地降解DNA:RNA杂合链中的RNA部分；2.在分子克隆中，RNaseH主要用于与大肠杆菌DNA聚合酶I和DNA连接酶一起参与cDNA克隆中cDNA的第二条互补链的合成。3.通过反义寡聚DNA与RNA产生局部的RNA:DNA双链体，诱发特异性的RNA降解，从而有效地对特定基因的表达进行调控。如何正确利用各种核酸酶从mRNA获得双链cDNA第三章载体的含义及其功能类型福建农林大学生命科学学院2010级生物学基地班4能携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、整合或表达的工具就称为载体（vector）。功能类型：1.运送外源基因高效转入受体细胞；2.为外源基因提供复制能力或整合能力；3.为外源基因的扩增表达提供必要的条件。克隆载体的基本条件及其主要类型克隆载体是用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体。必须满足如下基本条件：①具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；②能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；③具有由单一限制性内切核酸酶识别位点组成的多克隆位点（MCS），可供外源基因的插入；④具有合适的选择性标记，用于含有重组质粒的宿主细胞筛选。主要类型：质粒载体；噬菌体载体；噬菌体—质粒杂合载体；人工染色体根据质粒在宿主细胞中的拷贝数，可将质粒的复制方式分为哪些类型，在应用上有何区别？根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，可分为：“严紧型”复制控制质粒(拷贝数少，为1-5个)和“松弛型”复制控制质粒(拷贝数多，可达10-200个拷贝)。作为载体的质粒应该是松弛型的。质粒的不相容性的含义：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒一般不能够在同一宿主细胞中稳定共存。天然质粒往往需要哪些方面的改造才能成为合适的克隆载体1.选择合适的复制起始位点，为了使构建的质粒克隆载体能在受体细胞有效复制，需要改变复制起始位点，一般选择组装松散型质粒复制起点；2.加入合适的选择标记基因；3.增加或减少酶切位点。增加由多种单一限制性核酸内切酶识别序列的多克隆位点，减少部分重复的限制性内切酶识别位点。4.缩短长度，小分子质量的质粒转化效率较高。指出常用质粒载体pBR322与PUC18之间的差异，并列出pUC18载体的优点差异：1、pUC18的复制起点来自突变的pMB1，缺乏控制拷贝数的rop基因；2、pUC18保留了pBR322氨苄青霉素抗性基因（ampr）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的限制性内切核酸酶的识别位点。3、pUC18含有lacZ’基因，在特定的受体细胞中可表现α—互补作用，形成的蓝、白菌落可用于筛选重组质粒。4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。（删除：但它并不破坏该基因的功能。）pUC18载体的优点：1、具有较小的分子量和更高的拷贝数;2、适用于组织化学检测重组体（蓝白斑试验）3、具有多克隆位点MCS区段适于具有不同黏性末端的外源片断的插入。TA载体的含义及其应用含义：是一种5′端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶（T）线性质粒载体。应用：用该载体可进行PCR产物的直接克隆。λ噬菌体载体类型及其应用上的差别类型：插入型载体和替换型载体。插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆；替换型载体则可以承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。福建农林大学生命科学学院2010级生物学基地班5cosmid载体由哪些要素组成，如何使用该载体？Cosmid克隆载体由质粒和含有cos位点的λDNA片段所组成，大小一般在5-7kb，包括质粒的复制起点、抗性标记基因、多克隆位点和λDNA的cos位点。使用：限制性内切酶酶切真核DNA和cosmid质粒；体外连接酶切片段DNA；体外包装重组DNA；转染大肠杆菌；DNA－cos杂种分子通过cos位点环化，并按质粒方式进行复制和表达其抗药性记号；筛选转化子。（p4