《生物化学实验》(精)

《生物化学实验》周小慧实验室规则１、自觉遵守学习纪律，保持实验室肃静，不得喧哗吵闹、迟到早退，更不得缺席。２、爱护仪器，厉行节约。试剂、药品、蒸馏水等应节约使用，不得浪费。如不慎损坏仪器，应及时报告老师，说明原因，经老师同意后，方可换领。并应按规定赔偿或处理。贵重、精密仪器，应先熟悉使用方法，在老师的指导下，严格按操作规程操作，发现故障，应立即报告老师，不得擅自处理。实验室规则３、取用试剂时，应仔细辨明标签，以免取错。取完试剂后，应及时将瓶盖盖好，放回原处，切忌乱拿乱放，“张冠李戴”。４、注意安全，用吸量管吸取试剂时应使用吸球，严禁用嘴吸取。对于有毒、腐蚀的试剂更应注意，应避免其直接接触人体及衣物。乙醚、丙酮等易燃试剂应远离火源，以免发生意外。实验室规则５、注意实验室卫生、整洁。废弃液体应倒入水槽，放水冲走，实验用过的和棉花、废纸、沉淀废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器，不得随意乱扔或丢进水槽。实验结束后应将实验台整理好。并清扫、整理实验室。关好水、电、门、窗，经老师检查同意后，方可离开实验室。实验须知１、实验前应作好预习，认真阅读实验指导。明确学习目标，能简述实验内容及主要的操作步骤。２、实验过程中，应根据实验指导及老师的要求，认真操作，细心观察，如实记录。严禁捏造实验数据，提倡实事求是的科学态度，实验做错应要求重做，反对弄虚作假。３、实验结束后，要认真书写实验报告，及时交老师批阅。实验报告包括如下内容：①实验项目、②实验原理、③主要操作步骤、④实验结果、⑤分析与讨论等。实验报告实验报告包括如下内容：１、实验项目２、实验原理３、主要操作步骤4、实验结果5、分析与讨论等实验项目实验1:改良双缩脲试剂测定种子蛋白质含量实验2:维生素C的测定实验3:鞣质含量的测定(络合滴定法)实验4:植物组织中过氧化物酶活性的测定实验5:淀粉的分离制备与净化实验6:总淀粉量的测定实验7:糖苷的提取、分离、精制与检识实验8:Cytc的制备及测定实验1:改良双缩脲试剂测定种子蛋白质含量一、实验原理：具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用来测定蛋白质的浓度。蛋白质或多肽加热稀碱溶液CuSO4紫红色二、操作步骤1、1、制作标准曲线：取12支干试管，编号，按下表平行操作。012345标准蛋白液/mL蒸馏水/mL双缩脲试剂/mL02.010.00.41.610.00.81.210.01.20.810.01.60.410.02.0010.0摇匀，置40℃水浴中保温15min，然后以0号试管为空白对照，在550nm处比色A550蛋白质浓度mg/mL以A550（取两组测定的平均值）为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。y=0.0641x+0.0004R2=0.997200.020.040.060.080.10.1200.511.52蛋白质浓度（mg/mL）A55000.330.6711.331.6700.0230.0430.0650.0820.11二、操作步骤1、样品测定将板栗剥壳去皮，剪碎→称0.3g两份研成浆状→加2mlAUC溶液，反复研磨抽提10分钟→转入试管中，并用10ml双缩脲洗研钵，一并转入试管摇匀→置40℃水浴中保温15分钟→棉花过滤→去渣，滤液澄清透明（V滤液=），测A550→从标准曲线上求得测定样品蛋白质的浓度，计算测定样品中蛋白质的毫克数。三、结果计算蛋白质含量（%）=测得蛋白质的毫克数鲜样重×1001000思考题1、干扰本实验的因素有哪些？2、简述蛋白质的呈色反应？3、试比较凯氏定氮法和比色法的优缺点？实验2:维生素C的测定2,6—二氯酚靛酚滴定法一、实验原理：维生素C（抗坏血酸）具有很强的还原性。还原型抗坏血酸能将染料2.6-二氯酚靛酚还原成无色的2.6-二氯酚靛酚，本身则氧化为脱氢抗坏血酸。在中性或碱性溶液中，氧化型2.6-二氯酚靛酚呈蓝色；在酸性溶液中呈红色，被还原后变无色，因此，当用2.6-二氯酚靛酚滴定样品中还原型抗坏血酸时，在抗坏血酸尚未全部被氧化时，滴下的2.6-二氯酚靛酚立即被还原成无色。当抗坏血酸全部被氧化后，则滴下的染料立即使溶液呈淡红色，即为终点。还原型抗坏血酸氧化型2.6-二氯酚靛酚（红色）还原型2.6-二氯酚靛酚（无色）氧化型2.6-二氯酚靛酚（蓝色）O=C|HO—C‖HO—C|H—C|HO—CH|CH2OHOO=C|O=C|O=C|H—C|HO—CH|CH2OHO脱氢抗坏血酸=N——O-Cl|O=|Cl=N——OHCl|O=|ClN——OHCl|HO|Cl——|H实验原理H+OH-二、操作步骤1.提取：洗净待测材料,吸干表面水分，然后称取0.5g，加2%草酸200ML（抑制抗坏血酸氧化酶），在高速组织捣碎机中打成匀浆。称取浆状物5.0g，放入小烧杯中，然后转入50ML容量瓶中，以2%草酸洗净烧杯，并定容至刻度，充分摇动，然后静置10分钟，过滤于50ML三角瓶中（最初数毫升滤液弃去）滤液保留备用（如浆状物泡沫很多可以加数滴辛醇或丁醇）。二、操作步骤2.滴定①2.6-二氯酚靛酚的标定准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0mg（含0.1mg抗坏血酸）置100ML三角瓶中，加9ML1%草酸微量滴定管以0.02%2.6-二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保存15秒钟即为终点，这样便可算出1ml染料相当于抗坏血酸的mg数（T）。T=每ml标准液抗坏血酸的mg数×所取ml数滴定时所消耗的染料ml数二、操作步骤②样品滴定准确吸取滤液两份，每份10.0ML分别放入两个100ML三角瓶内，立即用以标定过的染料滴定至粉红色，并保存15秒即为终点。记录所消耗染料ML数。三、结果计算实验结果滴定时所用去染料ml数：V1=V2=V=计算抗坏血酸毫克数/100克样品=VTW×100V---为滴定时所用去的染料ML数T---1ML染料氧化抗坏血酸mg数W---10ML样品溶液相当于含样品之克数。实验3:鞣质含量的测定(络合滴定法)植物鞣质（单宁质）属于次生物质存在：植物中（如在食用植物中，有的在未成熟时含有大量的鞣质。）化学本质：鞣质是高分子多元酚衍生物植物鞣质（单宁质）性质：①有涩味（是植物可食部分涩味的主要来源）。②易氧化。③易与金属离子反应生成褐黑色物质。④重金属离子可与鞣质生成不溶性盐。⑤易溶于水、丙酮、乙醇等。不溶于烃类、氯仿、无水乙醚等中。一、实验原理鞣质与金属离子形成络合沉淀，用EDTA滴定Zn(Ac)2标准溶液,计算络合沉淀过程中EDTA消耗量即可算出鞣质含量。二、仪器与药品研钵,玻棒,三角瓶,滴定管,吸管,滴瓶,漏斗,滤纸,天平,水浴锅,EDTA,Zn(Ac)2，NH4Cl，络黑T试剂:0.05MEDTA钠盐pH10NH4Cl-NH4OHbuffer溶液络黑T1MZn(Ac)2溶液三、操作步骤1、切碎材料称5∼10g研成匀浆状（石英砂），转入100ml三角瓶中加水50ml搅拌抽提10∼15分钟。2、在100ml容量瓶中，准确加入5ml醋酸锌和3.5ml氨水，摇匀使白色沉淀溶解。在此容量瓶中加入样品抽提物，振荡，置35℃水浴20∼30分钟（振荡数次），冷却，定容至100ml，过滤。3、吸取滤液10ml两份，分别加40ml水，12.5mlpH10的NH4Cl-NH4OH缓冲液，10滴络黑T，摇匀，以EDTA滴定溶液，溶液由红色变为兰色，为滴定终点，记录数据。四、结果与计算Q1=mlQ2=mlQ0=(Q1+Q2)/2=mlV=5*MZn-10*MEDTA*Q0鞣质含量（%）=0.1556*V*100/W实验4:植物组织中过氧化物酶活性的测定一、实验原理过氧化物酶是植物体内普遍存在活性较高的一种酶,它与光合作用、呼吸作用及生长素的氧化有关系。在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，测定它的含量可以反映某一时期植物体内代谢的变化。过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。二、实验步骤1、粗酶液的提取称取植物材料0.2g，加20mmol/LKH2PO45mL（研磨用2-3毫升，余下的再用来冲洗研钵）和少量石英砂于研钵中研磨成匀浆，转入离心管，以4000r/min离心15min，收集上清液保存在冷处。所用试剂、研钵先低温保存，研磨过程需低温。二、实验步骤2、酶活性的测定取光径1cm比色杯2只，于一只中加入反应混合液3mL,KH2PO41mL，作为校零对照。另一只中加入反应混合液3mL，上述酶液1mL（如酶活性过高可适当稀释），立即开启秒表计时，于分光光度计470nm波长下测量A值，每隔20秒读数一次,计时3分钟。以每分钟内A470变化0.01表示1个酶活性单位(u)。3、记录结果（每20秒记录一次读数）计时20s40s60s80s100s120s140s160s180sA470A4704、结果计算ΔA470*Vt酶总活力[u/(g·min)]=—————————W*Vs*0.01*T式中：ΔA470：反应时间内吸光度的变化。Vt：提取酶液总体积,ml；W：植物鲜重，g。Vs：测定时取用酶液体积,ml。T：反应时间，min.实验5:淀粉的分离制备与纯化一、实验原理淀粉是储藏物质。大量的淀粉主要存在于种子及茎块中，禾谷类种子含淀粉50%–80%，板栗含淀粉50%–70%。淀粉以粒状形式存在。淀粉粒的主要成分是多糖，约占95%以上，此外还含有少量矿物质、磷酸和脂肪酸。不同作物种子的淀粉，淀粉粒的形态和大小均不同，根据这种性质可鉴定淀粉的种类。淀粉是白色无定形粉末，由直链淀粉与支链淀粉两部分组成，它们在淀粉中的比例随植物的品种而异，一般直链淀粉在淀粉中约为20%–25%，支链淀粉为75%–80%。直链淀粉溶于热水，但不成糊状，遇碘呈蓝色；支链淀粉不溶于水，与热水作用则膨胀而成糊状。二、操作方法1．淀粉的制备将红薯去皮，洗净后切碎，以1：3（W/V）比例加水混合，在高速组织捣碎机中捣碎。然后用三层纱布过滤，滤渣再用少量水冲洗2次-3次，收集滤液，滤液静置2h-3h后倒去上清液，沉淀再用水反复冲洗，用4层-5层纱布再过滤一次，滤液澄清后倒去上层清液，保留沉淀。二、操作方法2．淀粉净化向沉淀中加入10%NaCl溶液（用量相当于沉淀的4倍-5倍体积），反复搅拌10min-20min，澄清后倒去上清液，如此再重复一次，以除去蛋白质。沉淀用水洗2次，并反复搅匀，静置使淀粉沉淀下来。沉淀再用少量乙醇洗涤2次–3次，倾出乙醇洗涤液，沉淀转入培养皿风干，再放入40℃–45℃烘箱烘干，即为淀粉制品。3.计算淀粉产率实验6:总淀粉量的测定一、实验原理淀粉为葡萄糖α-1.4苷键呈6个葡萄残基为一周的螺旋结构，葡萄糖残基上羟基朝向圈内。当碘分子进入圈内时，羟基成为电子供体，碘分子成为电子受体，形成淀粉-碘络合物，呈现兰色。溶液呈色的强度与淀粉含量呈正相关。在625nm下测定溶液的吸光度，根据标准曲线便可求出淀粉含量。由于淀粉-碘复合物的着色与淀粉组分有关，因此制作标准曲线的标准淀粉应该与被测样品的淀粉是同一种类型的，本实验采用自制的红薯纯淀粉作为标准。二、实验步骤1、制作标准曲线：称取标准淀粉0.2000克，加水1ml调成糊状，然后十分小心地慢慢加入3.2ml60%高氯酸，轻轻搅拌5-10min后加水定容至500ml。此液为400ppM标准淀粉原液。取7支试管分别加标准淀粉原液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，然后各加2ml碘试剂，充分摇匀，放置室温显色5-10分钟，最后用水定容至10ml。充分摇匀后即成0（空白）、20、40、60、80、100、120ppM标准淀粉系列显色液。在625nm处比色，测吸光度。以吸光度为纵座标，标准淀粉液浓度（ppM）为横座标，绘制标准曲线。二、实验步骤2、总淀粉含量的测定：称取淀粉制品