细胞工程期末复习资料

细胞工程第一章论绪1、细胞工程：按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。(1)分类a.按生物类型分为：动物细胞工程、植物细胞工程、微生物细胞工程b.按实验操作对象分为：细胞与组织培养、细胞融合、细胞核移植、染色体操作、转基因工程。(2)操作水平：细胞整体水平或细胞器水平(3)目的：定向改变遗传物质或获得细胞产品(4)理论基础：细胞全能性(5)依据：生物体的每一个干细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。2、植物细胞工程包括：植物体细胞杂交、植物组织培养。3、动物细胞工程包括：动物细胞融合、动物细胞培养、单克隆抗体技术、核移植、胚胎移植。4、细胞工程研究内容(1)细胞与组织培养（离体培养）：是细胞工程的最基本技术。(2)细胞融合（细胞杂交）：自然融合、人工诱导融合。试管婴儿单克隆抗体技术(3)细胞核移植：克隆羊多莉(4)染色体工程：多倍体育种(5)胚胎工程：以生殖细胞和胚胎细胞为对象，包括体外受精、胚胎移植、胚胎切割。(6)干细胞与组织工程：胚胎干细胞、组织细胞。人工培养的肌肉、器官。5、细胞工程的应用：a.快速繁殖b.种苗脱毒c.动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种d.利用动植物细胞培养生产活性产物、药品（生物反应器工程），如利用动物细胞融合形成单克隆抗体，利用植物细胞培养次生代谢产物。e.新型动植物品种的培育f.供医学器官修复或移植的组织工程g.珍稀动植物资源的保存与保护h.在遗传学、发育生物学领域的理论研究第二章细胞全能性与形态发生1、名词解释：细胞全能性：细胞经分裂和分化后仍具有形成完整个体的潜能或特性。极性：指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。离体器官发生：培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。细胞分化：导致细胞形成不同结构或引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。脱分化：离体培养条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂，逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织，或成为未分化细胞特性的过程。再分化：离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官、甚至形成完整植株的过程。胚状体：在植物组织培养中，起源于一个非合子细胞、经过胚胎发生和胚胎发育过程形成具有双极性的胚状结构，叫做胚状体或体细胞胚胎。愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分裂产生无组织、无明显极性的松散的细胞团。2、植物的再生途径：植物再生的各种途径，与实验材料和培养基、添加的激素有关。3、愈伤组织的种类：a.胚性愈伤组织：表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。易形成胚状体，所以被称为胚性愈伤组织。b.非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、细胞大。4、不定根：从茎、叶上生出的根叫做不定根。不定芽：不是从叶腋或枝顶发出，而是从叶子、根上或从树干上发出的芽。5、离体培养中通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式：a.先芽后根；如小麦，芦荟、苹果。b.先根后芽；如枸杞、苜蓿等。c.在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。如胡萝卜、石刁柏。第三章植物细胞工程常规技术1、细胞工程实验室一般由培养基制备室、无菌操作室、培养室、显微观察室和移栽驯化室。其中培养基制备室由洗涤间、制备间和消毒间3部分组成；无菌操作室通常由里外两件组成，外间是缓冲间，用于准备工作，内间是接种间，用于接种；培养室可分为光照培养室和暗培养室。2、常用的洗涤液类型（5种）：铬酸洗液、碱性高锰酸钾洗液、磷酸钠洗液、硝酸-过氧化氢洗液、强碱洗液。3、灭菌的方法：1)物理方法：干热、湿热、过滤(0.25微米）、紫外灯、超声波等。2)化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等。a.干热灭菌：适用于玻璃器皿和金属器械。操作时间：150℃，40min120℃，120min③160℃，90-~120min（芽孢杆菌）b.湿热灭菌：适用于各种器皿、培养基、蒸馏水、棉塞、纸。操作时间：120℃，20-~30minc.过滤灭菌：适用于某些生长因子、赤霉素、酶液、血清、玉米素、脱落酸、尿素、维生素。d.射线灭菌：适用于实验室操作台。操作时间：20~30mine.火焰灼烧灭菌：适用于接种器皿。f.消毒剂：适用于外植体、实验器皿、操作表面、皮肤。4、外植体：指无菌条件下，离体培养于人工培养基上的、用于达到某种培养目的的原始植物材料。5、外植体消毒方法：取材后－将老的组织去掉－自来水冲洗－洗衣粉水洗（简单杀菌）－自来水冲洗－70％酒精处理－消毒剂处理－－灭菌蒸馏水冲洗3－5遍。其中，消毒时采用的消毒剂及其浓度处理时间等，均应根据材料的情况及对消毒剂的敏感性来定；消毒时间因植物老嫩程度不同而不同，一般，较老的材料相对杀菌时间长，反之较短。消毒剂种类有很多，如次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔姆林等。次氯酸钠效果应该比较好，无毒、无污染、但往往由于储藏、运输过程中不注意，见光氧化，影响杀菌效果。一般多用升汞。一般杀菌，酒精10秒，升汞5－12分钟。6、外植体的选择：P46用于外植体分离的母体植物材料一般有3种来源：一是生长在自然环境下的植物；二是在温室控制环境条件下生长的植物；三是无菌环境下已经离体培养过的植物。（1）选择优良的基因型试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的材料，并且品种一定要可靠。花卉、观赏植物的快繁，也应选择有价值的植物。（2）取材从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母株代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容易成功。（3）外植体大小选择因外植体不同而不同。如利用茎尖培养，茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，胚龄也非常重要。（4）选择外植体的时期外植体的生长动态往往与该物种的生长规律（生物钟）有关。因此，最好在植物生长的最适宜时期取材培养。会得到较好的结果。7、外植体的处理：（1）取材母株的预处理人工管理，促进母株生长旺盛、代谢活跃，从其上取材培养，容易成功。（2）外植体休眠的处理有些植物的种子、幼胚、或芽，存在休眠。为了打破休眠，可利用低温处理，或赤霉素等化学物质处理。因植物不同处理温度和时间有所不同。（3）外植体的灭菌大田或温室植物材料，都带有大量的细菌和真菌，这是组织培养的一大障碍，所以材料必须进行杀菌消毒（表面杀菌）组织内生菌的处理（1）加入抗生素，注意抗生素的用量，高浓度容易造成培养物的死亡（2）取生长期旺盛的生长点部位作为起始培养的外植体。（3）取被内生菌污染的培养物的茎尖不停的转接。8、培养基的组成和作用（一）无机营养大量元素：N（硝酸盐或铵盐）,P,K,Ca,Mg,S微量元素：Fe,Mn,Zn,Mo,Cu,Cl（二）有机营养（1）维生素类物质硫胺素（VB1）：愈伤组织的产生和生活力有关烟酸（VB3、维生素PP）：促进胚的发育③盐酸吡哆醇（VB6）：促进根的生长④其它：泛酸钙（VB5）、生物素（VH）、钴胺素（VB12）、叶酸（VBc）（2）氨基酸类物质甘氨酸（Gly）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）水解乳蛋白、水解酪蛋白（3）糖类蔗糖（植物）、葡萄糖（动物）、果糖、麦芽糖作用：为细胞提供合成新物质的碳骨架；为细胞的呼吸代谢提供底物和能量；维持渗透压。（4）其它有机物质肌醇：细胞壁的构建物质；参与细胞膜的组成；利于胚和芽的形成。天然有机物：椰乳、番茄提取物、酵母提取物。（三）植物生长调节物质（1）生长素类吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）作用：a.促进细胞生长和细胞分裂b.诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力c.形成愈伤组织，促进生根d.与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。（2）细胞分裂素KT/KIN、6-BA（最常用）、ZT（玉米素）、ZIP作用：a.促进细胞的分裂和分化b.诱导芽的分化c.促进侧芽的萌发和生长d.抑制衰老分裂素/生长素比例高时——产生芽,比例低时——产生根（3）赤霉素（GA3）——不耐热，应采用过滤灭菌作用：a.诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效b.对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。IAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化。c.破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。d.对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用（4）脱落酸（ABA）作用：a.抑制蛋白质的合成b.抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GA的作用c.诱导休眠、促进衰老和脱落（四）附加物常用的附加物：琼脂、活性炭、琼脂糖、天然复合物（椰乳、酵母提取物等）等。9、培养基的种类（按无机盐浓度不同）（1）高无机盐含量培养基钾盐、铵盐和硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。MS、LS、BL、BM、ER培养基。（2）高硝态氮培养基含较高的硝酸钾和VB1，氨态氮的含量低，适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。B5、N6、SH培养基（3）中等无机盐含量培养基大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较MS的高，维生素种类比MS多，如增加了生物素、叶酸等。适合于花药培养。Nitch，NT、H、Miller培养基（4）低无机盐含量培养基大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量相对也很低。多数用于生根培养基。White、Heller、WS、HE、HB培养基10、初代培养：指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养：指用来接种继初代培养物的培养基。11、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。基本培养基（就是通常称呼的培养基）：主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。完全培养基：在基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。12、培养条件的选择①光照：培养中光照主要表现在光强、光质、以及光周期等方面。a.光周期的需要与否，应根据植物种类、培养的目的来决定。最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依据植物种类不同做法不同，多数植物适合全暗或周期性光照；器官发生阶段：一般给予周期性光照比较好。b.光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。高光量可以降低植物体内生长素水平，低光量使植物体内生长素素水平较高，容易生根离体培养条件下常用的光量，一般为1000-4000lx（勒克斯）。离体培养中通常难以达到4000lx，一般光量在2000-3000lx。c.光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。离体培养条件下，一般用日光灯进行光照，光谱成分主要是蓝紫光，波长为419-467nm。对芽分化有效光谱成分为蓝紫光，根分化则受600-680nm所刺激。②温度：培养都是在23～27℃之间进行，一般采用25±2℃。③湿度：组织培养中湿度的影响有两个方面：a.培养容器内的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。b.环境的湿度条件。环境的相对湿度一般要求70～80%。常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。④PH值：不同的植物对培养基最适PH值的要求是不同的，大多在5.5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8。一般来说pH值高于6.5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低pH值（约0.2-0.3个pH值）因此在配制时常提高pH值0.2-0.3单位。⑤渗透压：通常1-2个大