转基因和基因敲除技术(及英文文献讲解)

•定义与原理•常用方法•研究前景与运用定义转基因技术：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的变化，这一技术称之为转基因技术（Transgenetechnology）。转基因技术基本原理1、目的基因的获取2、克隆载体的选择和构建3、外源基因与载体的连接4、DNA导入受体5、重组体的筛选6、克隆基因的表达重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定分子杂交目录(插入失活法)抗药性标记选择目录原位杂交目录Southern印迹目录常用的植物转基因方法遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可分成两大类:1、需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；2、不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管通道法。常用的动物转基因技术1．核显微注射法2．精子介导的基因转移3．核移植转基因法4．体细胞核移植法过去的几千年里农作物改良的方式主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然的方式来积累优良基因。遗传学创立后近百年的动植物育种则是采用人工杂交的方法，进行优良基因的重组和外源基因的导入而实现遗传改良。因此，转基因技术与传统技术是一脉相承的，其本质都是通过获得优良基因进行遗传改良。转基因技术发展情况一是品种培育速度加快。随着生命科学、基因组学、信息学等学科的发展，目前全球转基因生物新品种已从抗虫和抗除草剂等第一代产品，向改善营养品质和提高产量的第二代产品，以及工业、医药和生物反应器等第三代产品转变，多基因聚合二是产业化应用规模迅速扩大。全球已有25个国家批准了24种转基因作物的商业化应用。转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积迅速增长。三是生态和经济效益十分显著。1996至2007年，全球转基因作物的累计收益高达440亿美元，累计减少杀虫剂使用35.9万吨。2008年，全球转基因产品市场价值达到75亿美元。植物：抗虫、抗病、抗除草剂植物培育、改良作物品质（富含赖氨酸的玉米）动物：提高生长速度、生产药物蛋白、器官移植、乳腺生物反应器微生物：疫苗基因治疗，生物治疗，基因诊断，疾病基因的发现与克隆、遗传病的预防应用基因敲除(knock-out)•定义•方法•现状定义利用基因同源重组进行基因敲除发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。同源重组需要一些重组蛋白和酶，如RecA、B、C、D及DNA连接酶等最为广泛Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤：①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体RNA干扰引起的基因敲除利用随机插入突变进行基因敲除即基因捕获法：利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。研究现状现在基因敲除技术主要应用动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。文献讲解技术原理：同源重组的基因敲除实验目的：用胚胎干细胞为基础的基因打靶技术方法，构建基因敲除（p53）的大鼠模型。位于10号染色体上，包括10个外显子，其中启动子外显子2上6.7kb1.6kbdarkagouti(DA)ratES-cellgenomicDNAPositiveselectionnegativeselectionPGK-DTA(磷酸甘油酸激酶1-白喉毒素-A链)不参与同源重组，它的随机插入是为了减少含有随机目标媒介插入的耐抗生素型ES细胞，以富集正确的目标细胞。构建基因载体DAEScell电穿孔法培养基中加入抗生素扩增耐抗生素克隆体PCR和Southernblotanalysis鉴定中靶细胞obtained14p53gene-targetedDAratES-cellclones相差镜检法荧光影像PCRDAc8-p53-1EScell79blastocysts（囊胚）显微注射嵌合体pseudo-pregnantfemaleSprague–Dawleyrats转移Twenty-fourlive-bornpups10malepups6femalepupscollectedfromE4.5Fischer344(F344)ratsfemaleSprague–Dawleyrats交配over600offspringonecarriedtheDAratES-cellgenomeidentifiedbytheappearanceofagouticoatcolour产24只幼鼠，其中10只公鼠和6只母鼠被着色，说明存在DAc8-p53-1。PCRgenotypingresultsshowedthatthisgermlineanimaldidnotinheritthegene-targetedp53alleleFailureofmouseEScellschromosomalabnormalitiesinEScellsover65%ofthecellswerepolyploid（多倍体）DAc8-p53-1EScell染色体组型分析whethergermlinecompetencyofDAc8-p53-1ratEScellscouldbeimprovedthroughsubcloningAround10%ofthecellsformedroundandcompactcoloniesidentified2subcloneswitheuploidchromosomenumbers扩增建立亚克隆inheritancethegene-targetedp53allele2subclones39F344ratblastocysts显微注射agermlinechimaera76offspring6germlinepups公母9/12纯合子summary12