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关于汽酒中微生物的检查1主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。本标准适用于出口食品的检验。2设备和材料2.1吸管:1mL,具0.1mL刻度;5mL和10mL,具1mL刻度。2.2水浴箱:44.5±0.5℃。2.3培养箱:36±1℃,44.5±0.5℃。2.4冰箱:0~5℃和-15~-20℃。2.5均质器。2.6乳钵和研棒。2.7平皿:直径90mm。2.8天平:感量0.1g。2.9显微镜。2.10稀释瓶:100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。2.11玻璃珠:直径约5mm。2.12菌落计数器。3培养基及试剂3.1月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。3.2煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。3.3EC肉汤。3.4伊红美蓝琼脂(EMB)。3.5营养琼脂斜面。3.6色氨酸肉汤。3.7MR-VP培养基。3.8Korser氏枸椽酸盐肉汤。3.9结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。3.10Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。3.11生理盐水。3.12革兰氏染色液。3.13Kovacs氏靛基质试剂。3.14甲基红指示剂。3.15Voges-proskauer(V-P)试剂。4样品制备4.1以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保存;非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2~5℃18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。4.2不同食品样品匀液的制备4.2.1液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠),以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。4.2.2固体和半固体食品以无菌操作取25g样品,放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1~2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。4.3稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。5大肠菌群的测定5.1大肠菌群MPN值的测定5.1.1对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。5.1.2将接种管置于36±1℃培养48±2h。5.1.3观察试管的产气情况:检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性;如有产气者,则进一步作证实试验。5.2大肠菌群的证实试验5.2.1将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。5.2.2置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。5.2.3记录所有BGLB肉汤管的产气管数。5.2.4结果报告:按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B(补充件)]报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。6粪大肠菌群测定6.1用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。6.2将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。6.3记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性;不产气管为粪大肠菌群试验阴性。6.4结果报告:按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。7大肠杆菌测定7.1将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。7.2检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。7.3如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落;如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18~24h。7.4将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。7.4.1色氨酸肉汤:在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2~0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。7.4.2MR-VP培养基:在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1mL至13mm×100mm试管中,加5%α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40%氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。7.4.3Koser氏枸椽酸盐肉汤:于36±1℃培养96h记录有无生长。7.4.4LST肉汤:于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。7.4.5革兰氏染色:取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。7.4.6大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下:━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━靛基质┃MR┃VP┃枸椽酸盐┃鉴定(型别)━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━+┃+┃-┃-┃典型大肠杆菌-┃+┃-┃-┃非典型大肠杆菌━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━+┃+┃-┃+┃典型中间型-┃+┃-┃+┃非典型中间型━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━-┃-┃+┃+┃典型产气肠杆菌+┃-┃+┃+┃非典型产气肠杆菌━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做重复试验。7.5结果报告:大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为++--或-+--,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。8大肠菌群固体培养基测定法8.1样品制备同第4章。8.2计数8.2.1选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。8.2.2将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10~15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。8.2.3待琼脂凝固后,再加3~4mLVRBA覆盖平板表层。8.2.4翻转平板,置于36±1℃培养18~24h。8.2.5选用有30~150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。8.2.6证实8.2.6.1从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内,36±1℃培养24h和48h,观察产气情况。8.2.6.2将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。8.2.7结果报告经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。例:10**-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×10**4/g(mL)=6.0×10**5/g(mL)附录A培养基和试剂(补充件)A1月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase)20g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)2.75g磷酸二氢钾(KH2PO4)2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。A2煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液200.0mL0.1%煌绿水溶液13.3mL蒸馏水1000.0mL将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中,pH7.0~7.5),用蒸馏水稀释到975mL,调pH7.4。再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH7.2±0.1。A3EC肉汤胰蛋白(月示)或胰酪(月示)20.0g3号胆盐或混合胆盐1.5g乳糖5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)4.0g磷酸二氢钾(KH2PO4)1.5g氯化钠5.0g蒸馏水1000.0mL将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL。121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.1。A4伊红美蓝琼脂(EMB)蛋白胨10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)2.0g琼脂15.0g伊红γ(水溶性)0.4g或2%水溶液20mL美蓝0.065g或0.5%水溶液13mL蒸馏水1000.0mL在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL或200mL,高压灭菌15min。最终pH7.1±0.2。使用前将琼脂融化,于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊红γ水溶液和1.3mL0.5%的美蓝水溶液,摇匀,冷至45~50℃倾注平皿。A5营养琼脂斜面牛肉膏3.0g蛋白胨5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000.0mL将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。分装合适的试管。121℃高压灭菌15min。最终pH7.3±0.1。灭菌后摆成斜面备用。A6色氨酸肉汤胰胨或胰酪胨10.0g蒸馏水1000.0mL加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管,每管5mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.9±0.2。A7MR-VP培养基(月示)胨7.0g葡萄糖5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)5.0g蒸馏水1000.0mL将各成分溶于蒸馏水中,分装试管,121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.2。A8Koser氏枸椽酸盐肉汤磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O)1.5g磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g枸椽酸钠(含2H2O)3.0g蒸馏水1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10mL,121℃高压灭菌15min。最终pH6.7±0.2。A9结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化钠5.0g胆盐或3号胆盐1.5g中性红0.03g结晶紫0.002g琼脂15~18g蒸馏水1000.0mL将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调至pH7.4±0.1。煮沸2min,将培养基冷至45~50℃倾注平板。临用时制备,不得超过3h。A10Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液贮存液磷酸二氢钾(KH2PO4)34.0g蒸馏水500mL将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中,用1mol/L氢氧化钠约175mL调至pH7.2。用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。稀释液取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于合适容器后,121℃高压灭菌15min。A11生理盐水氯化钠8.5g蒸馏水1000.0mL将氯化钠溶于蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。A12革兰氏染色液结晶紫染色液:结晶紫1.0g95%乙醇20.0mL1%草酸铵水溶液80.0mL将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液:碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300.0mL将碘与碘化钾
本文标题:关于汽酒中微生物的检查(1)
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